论文部分内容阅读
目的:体外研究凋亡抑制基因Bcl-2小干扰RNA（RNAi）转染肺腺癌A549细胞后对其凋亡的影响,探讨Bcl-2小干扰RNA与A549细胞放射敏感性的关系,将小干扰RNA技术与放射治疗进行有机结合,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的新方法。方法:1.构建Bcl-2基因的干扰质粒pBcl-2-siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。应用Real time RT-PCR和Western blot的方法观察Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平表达上的变化,从而鉴定干扰质粒pBcl-2-siRNA的有效性。2.流式细胞术检测A549细胞凋亡率,量化凋亡结果,比较干扰质粒pBcl-2-siRNA组、无意义链组、空载体组和未转染组凋亡率的不同。并给予6Gy X线照射,再次比较以上四组细胞凋亡率的变化。3.克隆形成实验获得干扰质粒pBcl-2-siRNA组、无意义链组、空载体组和未转染组在各剂量下的细胞存活分数,利用统计软件完成细胞放射后存活曲线的拟和,证明干扰质粒pBcl-2-siRNA对A549细胞放射敏感性的增强效应。结果:1.成功构建了Bcl-2 SiRNA质粒,转染A549细胞后,经筛选获得稳定转染细胞株A549/Bcl2-Ins,Real time RT-PCR显示Bcl-2 mRNA表达明显降低,Western blot表明Bcl-2蛋白表达明显降低。证明A549细胞的Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平被成功抑制。2.流式细胞术检测A549/Bcl2-Ins凋亡率[（10.11±0.92）%]明显高于对照组[（5.52±0.48）%]等,6Gy X线照射后凋亡率[（28.81±1.10）%]明显高于对照组[（19.88±0.88）%]等,及未照射组[（5.52±0.48）%]等。证明Bcl-2 SiRNA质粒增加了A549细胞的凋亡,并与放射线有协同作用。3.克隆形成实验结果发现A549/Bcl2-Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列的细胞株A549/Bcl2-Neg（1.695和2.480）、转染空载体的细胞株A549/SD（1.706和2.227）和空白对照细胞A549（1.816和2.777）。A549/Bcl2-Ins较其他对照组放射增敏有显著差异（P＜0.05）。结论:1.本实验成功构建的Bcl-2 SiRNA质粒,能有效地抑制相应基因的表达。2.向A549细胞转染Bcl-2 SiRNA质粒能够显著增加细胞凋亡,并与放射线有协同作用。3.转染后A549细胞放射敏感性增加。