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赖脯胰岛素作为全球首个速效胰岛素类似物,皮下注射可以快速有效的发挥降血糖作用,所以被广泛用于糖尿病患者控制餐后血糖的升高。此外,与人胰岛素相比:它具有安全性高和患者依从性好等优点。目前,赖脯胰岛素全球市场规模在40亿美元左右,而国内市场大部分市场份额被礼来和诺和诺德等外企所垄断。由于,赖脯胰岛素的生产工艺具有一定的技术壁垒。所以,目前国产赖脯胰岛素只有速秀霖和万邦灵两个品牌。本文致力于赖脯胰岛素生产工艺的研发以期得到价格低、质量高的赖脯胰岛素,进而满足国内需求,降低患者的经济负担。本文采用原研公司―包涵体复性‖路线。在已构建保存菌种E.coli BL21(DE3)/pET28a-proLispro的基础上,进行了摇瓶与5L发酵罐的发酵条件优化,包涵体的产率较优化前提高了6倍。通过包涵体洗涤液成分(30.0mmol/LTris-Base,2.0mol/L尿素,pH 8.0)、变性液DTT浓度等试验方法,洗除了包涵体中大部分的杂蛋白,得到的变性液中包涵体蛋白浓度高达100.0mg/m L(干重)。通过―单因素‖,―正交‖和―响应面‖等试验方法的优化,最终在100.0mmol/L Tris-Base,50.0mmol/L甘氨酸,12.0mmol/L胱氨酸,1.0mmol/L半胱氨酸,8.0%山梨醇,2.0mol/L尿素,pH 10.0等复性条件下,复性液体积减少了4倍,复性收率提高了8倍,且有效的控制了错配胰岛素原的生成。调节复性液中胰蛋白酶的添加量,胰蛋白酶与羧肽酶B的比例等酶切条件,使得胰岛素原的酶切转化率在60%左右,酶切反应时间在210min左右。复性酶切液经阳离子交换层析与反相层析两步纯化后,经RP-HPLC分析,纯度达99.02%。阳离子交换层析与反相层析洗脱的样品,以参比制剂作为对照品,经RP-HPLC外标法确定赖脯胰岛素的浓度后,计算得出阳离子交换层析的收率为58.42%,反相纯化的收率为85.93%。整个分离纯化的总收率为50.20%。最终纯化的赖脯胰岛素经折算后产率为320mg/L(赖脯胰岛素的质量/发酵液的体积)。纯化后的赖脯胰岛素经质谱鉴定,分子量与理论值(5807.46)一致。随后以参比制剂作为对照品,经圆二色谱分析鉴定,结果皆与参比制剂一致,为工业化生产奠定了坚实的基础。