宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,是女性癌症的第二大常见肿瘤。每年有超过50万例的新发病例被报道,并且大多数病例都发生在发展中国家,尤其是在发展中国家的农村地区。其中,中美洲和南美洲、加勒比、撒哈拉以南的非洲和南亚是宫颈癌发病率最高的地区,并且患者年龄常在15-44岁之间。在部分地区,宫颈癌的发生甚至己经超越了女性恶性肿瘤第一位的乳腺癌。近年来随着早期筛查、检测技术及治疗方法的发展和推广,宫颈癌的诊断和治疗取得了显著进展,但是由于地域、经济及社会文化障碍等诸多的原因,许多发展中国家及地区的早期筛查受到限制。在印度,宫颈癌诊断分期通常较晚,超过80%的印度女性患者患有局部晚期(ⅡB-Ⅳa期),而在工业化国家通常不到50%。早期宫颈癌的预后一般良好,然而局部晚期宫颈癌的5年生存率则逐渐下降,从ⅡB期的58%、ⅢA期的35%、ⅢB期的32%,甚至到IVa期的16%。总体来说,宫颈癌的预后极差,复发或晚期宫颈癌患者的1年生存率仅为10-20%。宫颈癌的治疗是根据国际妇产科联合会(FIGO)的临床分期来进行的,常规治疗包括手术、放疗和化疗单独或联合使用。这些治疗方法效果一般,在40-50%的晚期癌症患者中仍然能观察到残留的肿瘤。化疗药物耐受、肿瘤侵袭和转移的发生导致治疗失败,也是导致大多数患者相关死亡的重要原因。人乳头状病毒(HPV)是乳头状病毒科的一种,有约8kb的非包膜双链环状DNA(dscDNA)基因组,对皮肤和粘膜上皮细胞有高亲嗜性,它可以导致多种肿瘤,包括外阴,阴道,阴茎,肛门,食管,头部和颈部等多个脏器的癌症。迄今发现的HPV种类达100多种,根据组织趋向性,分为皮肤型和粘膜型,根据致癌潜能将其分为高危型(HR-HPV)和低危型(LR-HPV)。在全球范围内,病毒感染导致的癌症占所有人类癌症的约15-20%,而其中5%的癌症是由HPV感染引起的。众多流行病学,临床和实验证据研究发现,宫颈癌的发生与HPV感染存在密切关系,尤其是高危型人乳头状病毒(HR-HPV),在宫颈癌变过程中发挥关键作用,其中有 13 种 HR-HPV 类型(HPV 类型 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68)被认为与宫颈癌前高度病变和浸润性宫颈癌有关,16和18型HPV是最常见且高度致癌的类型,可导致70%至80%的宫颈癌。另一方面,有 12 种不同的 LR-HPV 类型(6,11,40,42,43,44,53,54,61,72,73和81)与有生殖器疣和良性宫颈病变相关,如尖锐湿疣等,其中HPV 6和11型主要引起90%以上的生殖器疣。另外,早期性暴露,多个性伴侣,吸烟,长期使用口服避孕药以及同时合并感染2型单纯疱疹病毒或者人体免疫缺陷病毒(HIV)等某些性传播,可能增加患病风险。HPV中的癌蛋白能维持细胞增殖信号,逃避生长抑制因子的管控,细胞不断复制,抵抗细胞凋亡,持续血管生成,发生侵袭和转移,导致癌前病变的发生,最终发展为侵袭性癌症,这些过程受到多种信号通路的调控,共同作用参与调控肿瘤的发生及发展。因此肿瘤相关信号通路在宫颈癌细胞中的作用研究逐渐受到学者们的关注,这些改变的信号传导途径对于HPV相关癌症的起始和维持起到至关重要的作用,而针对这些癌蛋白激活的信号通路为宫颈癌的靶向治疗提供了方向。现在的研究普遍认为高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发生的先决条件,在己诊断的的宫颈癌病例中,有高达95%的病例发现了 HPV感染。HPV的早期(E)区编码蛋白质包括E1、E2、E4、E5、E6和E7,是病毒复制和转录所必需的;晚期(L)区域编码病毒组装,需要L1和L2两个结构衣壳蛋白。在HPV相关的癌变过程中,过度表达的E6和E7癌蛋白是宫颈上皮细胞向肿瘤转化的主要促癌因素,维持癌细胞的转化表型,因此在宫颈细胞癌变过程中上皮间质转化(EMT)过参与其中,并发挥重要作用。EMT是指己经分化成熟的上皮细胞获得部分间质细胞的生物学特性的生理过程,在肿瘤发生、发展及肿瘤的侵润、转移及复发等过程中存在密切联系。人类的大部分癌症是来源于上皮的实体瘤,Notch信号与小鼠实体瘤的连接最早出现在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)整合试验中。在数十年前,细胞内Notch 1在人类宫颈癌中首次被检测出,促使人们对这种通路在癌症中的可能发挥的作用进行了研究。但是Notch信号与HPV之间存在着复杂的相互作用,有实验报道了它们转录调控的复杂相互作用有剂量依赖性效应,也有数据证实了解除管制的Notch信号可以推动上皮转化的作用。在HPV相关的癌变过程中,多种信号通路和蛋白分子在宫颈癌细胞的发生及转移过程中发挥调控作用,其中EMT对增强宫颈癌细胞的侵袭、转移过程发挥关键作用。EMT不仅调控多种肿瘤细胞的发生、发展过程,而且其自身也受到复杂信号通路的调控,Notch信号通路及分子参与维持和调控EMT过程。然而Notch信号通路在宫颈癌EMT生物学过程中的功能目前尚未明确。因此,通过研究Notch信号通路在宫颈癌细胞形成、耐药及EMT转化之间的作用及机制,特异性的针对宫颈癌细胞的增殖、耐药、EMT等生物学过程进行靶向治疗,对提高宫颈癌的治疗效果将会显示重大意义。本课题通过实验证实Notch信号通路对宫颈癌细胞的增殖、耐药及EMT中的影响,发现Notch信号通路在调控宫颈癌增殖和EMT过程中发挥重要作用,特异性抑制Notch信号通路可以有效的抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、成瘤能力,为宫颈癌的联合用药和靶向治疗提供可靠的实验基础。第一部分宫颈癌细胞中Notch信号通路的作用研究目的:在恶性肿瘤的发生及进展过程中,Notch信号通路的调控机制非常复杂,而Notch信号通路在宫颈癌中的具体作用机制尚未明确。本课题的此章节会检测宫颈癌细胞中Notch信号通路及下游分子的表达情况,研究Notch信号通路对宫颈癌细胞增殖、耐药及转移能力的影响,为明确Notch信号通路在宫颈癌细胞中的作用机制提供实验依据。方法:通过流式细胞仪检测HPV-16-永生化宫颈上皮细胞系和宫颈癌细胞系中的Notch基因表达的情况;使用Western blot和荧光实时定量PCR,检测Notch信号通路的相关受体和下游靶基因Hes-1在两组细胞中的表达和转录的差异;无血清悬浮培养和平板克隆形成实验则用来体外评价宫颈癌细胞成瘤、耐药能力中Notch信号通路抑制剂的影响。结果:1、Notch2mRNA和蛋白质表达在转移性宫颈癌细胞系Caski细胞中最高,并且在非转移性宫颈癌细胞系Hela细胞中次之,在正常宫颈上皮细胞系CRL2614细胞中表达最低;2、γ-分泌酶抑制剂(RO4929097)可明显降低宫颈癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力;3、γ-分泌酶抑制剂(RO4929097)处理的宫颈癌细胞对顺铂诱导的细胞毒性的敏感性增加。结论:Notch信号通路及下游靶基因在宫颈癌细胞系中表达上调,其信号通路抑制剂(RO4929097)可阻断Notch途径并抑制宫颈癌细胞系的增殖、迁移和侵袭,抑制Notch信号传导途径可增加宫颈癌细胞对化学治疗药物的敏感性,对宫颈癌的发生和转移发挥重要作用。第二部分Notch信号通路在宫颈癌细胞EMT的作用研究目的:EMT过程的激活是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键步骤,而Notch信号通路作为EMT过程中的信号调控途径之一,同样在肿瘤耐药、转移等过程中发挥重要的作用。但在宫颈癌细胞中,尚无文献证实宫颈癌细胞中是否发生EMT转化,并且Notch信号通路对宫颈癌细胞EMT发挥何种调控作用亦未明确。本章节将探查EMT转化在宫颈癌细胞中表达情况,验证Notch信号通路对宫颈癌细胞EMT的作用机制,为宫颈癌的靶向治疗和联合用药提供新思路。方法:采用Western Blotting检测宫颈癌细胞中EMT标志性分子的转录水平;通过细胞划痕修复实验和Transwell细胞迁移实验检测宫颈癌细胞的迁移、侵润能力;使用Notch信号通路抑制剂检测对宫颈癌细胞中EMT的影响。结果:1、抑制Notch信号传导途径可降低宫颈癌细胞系中的EMT特异性标志物的表达;2、Notch信号通路抑制剂可降低宫颈癌细胞的迁移、侵润能力。结论:宫颈癌细胞发生EMT转化,并且Notch信号通路参与宫颈癌侵润、转移过程,对宫颈癌细胞发生EMT发挥协同作用。