研究背景：创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）是一种常见的高致残致死性中枢神经系统疾病，分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，原发性脑损伤可以通过加强预防来减少发生，而由原发性损伤所继发的一系列脑损害必须通过药物干预来改善。目前认为，继发性脑损伤的主要机制包括氧自由基的生成、兴奋性毒性氨基酸释放、钙离子超载和炎症反应等，已有研究表明，这些机制与突触致密物质(postsynapticdensity，PSD)和突触间信号传递密切相关。Homer蛋白家族分子主要存在于哺乳动物神经元PSD中，与其它PSD蛋白相互作用，在不同的脑组织和结构中发挥着不一样的功能。Homer1b/c是Homer1蛋白的亚型之一，为PSD中的重要支架蛋白，本课题组前期研究证实，离体神经元TBI后Homer1b/c呈持续稳定表达，下调Homer1b/c明显降低离体神经元TBI导致的损害，可以通过内质网和线粒体途径在一定程度上减弱外源性谷氨酸导致的皮层神经元损伤；由即早基因（immediate-early gene，IEG）编码的另一种Homer1蛋白亚型Homer1a在离体神经元TBI后呈动态高表达，过表达Homer1a在过氧化氢诱导的PC12细胞损伤中发挥保护性作用。自噬（Autophagy）是一种生物进化保守的溶酶体降解途径，能够清除细胞内异常或功能障碍的大分子或细胞器，来维持细胞能量平衡和内环境稳定。目前认为，适当的自噬对细胞有保护作用，自噬过少或过多对细胞均有损害作用。大量研究表明，自噬在中枢神经系统疾病中广泛存在，并发挥重要作用。TBI后有显著自噬发生，但其功能和调节机制尚不明确。本课题研究了自噬在神经元机械性损伤中的发生规律和功能，以及Homer1a蛋白对神经元机械性损伤诱导自噬的调节作用及其机制。第一部分神经元机械性损伤后自噬的发生规律目的明确小鼠大脑皮层离体神经元机械性损伤后自噬的发生规律。方法（1）细胞培养：昆明小鼠皮层神经元培养；（2）建立模型：建立稳定可靠的离体神经元机械性损伤模型模拟创伤性脑损伤；（3）细胞自噬监测：采用Western blot检测LC3Ⅱ和Beclin-1的表达；采用透射电镜观察神经元细胞质内自噬小体和自噬溶酶体数量；使用免疫荧光法检测LC3，观察自噬小体的数量变化；（4）自噬的干预：使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA干预自噬。结果小鼠大脑皮层离体神经元机械性损伤后3h自噬标志性相关分子LC3Ⅱ表达开始增加，且随时间变化逐渐增高；损伤组神经元Beclin-1分子表达显著高于对照组，但无明显时间变化趋势。免疫荧光法检测LC3证明，损伤后24h神经元自噬明显增加。电镜可见，离体神经元机械性损伤后24h胞质内有大量自噬小体或自噬溶酶体。结论离体神经元机械性损伤后有显著自噬发生。第二部分PI3K-Akt信号通路对神经元机械性损伤后自噬的调节作用目的研究PI3K-Akt信号通路对神经元机械性损伤诱导自噬的调节作用。方法（1）抑制PI3K-Akt信号通路：使用三个不同浓度（12.5μM、25μM和50μM）的PI3K抑制剂LY294002预处理，采用Western blot检测p-Akt来探索最佳抑制浓度；（2）自噬的干预：使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA干预自噬；（3）自噬检测：采用Western blot检测LC3Ⅱ和Beclin-1的表达。结果神经元机械性损伤后1hp-Akt表达开始增高，3h达到峰值，之后趋于下降，在24h基本回到正常水平；浓度为25μM的LY294002对PI3K抑制效果最明显，抑制PI3K后p-Akt显著下调，同时LC3Ⅱ和Beclin-1表达显著增高。结论PI3K-Akt信号通路对神经元机械性损伤后自噬有负调节作用。第三部分神经元机械性损伤诱导自噬的作用和功能目的探索自噬在神经元机械性损伤后的作用和功能。方法（1）神经元机械性损伤程度检测：采用LDH试剂盒、MTT法检测神经元活性；（2）自噬的干预：使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA干预自噬；（3）自噬检测：采用Westernblot检测LC3Ⅱ和Beclin-1的表达；（4）凋亡检测：采用Western blot检测cleaved-Caspase3、Caspase3；TUNEL染色。结果无论损伤前1h还是损伤后1h抑制自噬，LDH值均增高，损伤前抑制自噬神经元释放LDH的值较损伤后抑制自噬略高；无论损伤前1h还是损伤后1h抑制自噬，MTT值均降低，且损伤前抑制自噬比损伤后抑制自噬MTT值略低。损伤前1h激动自噬，神经元LDH释放增高，损伤后1h激动自噬LDH值则较对照组明显降低；MTT法检测细胞活性，结果显示损伤前1h激动自噬，神经元MTT值高于对照组，损伤后1h激动自噬MTT值则明显低于对照组。进一步研究发现，损伤后1h抑制自噬，损伤后24h神经元cleaved-Caspase3表达降低，TUNEL阳性细胞减少；损伤后1h激动自噬，损伤后24h神经元cleaved-Caspase3表达升高，TUNEL阳性细胞增加。结论无论在神经元机械性损伤前1h还是损伤后1h抑制自噬，均降低神经元活性；神经元机械性损伤前1h激动自噬细胞活性较对照组无显著差异，而损伤后1h激动自噬细胞活性明显改善。损伤后1h抑制自噬，神经元凋亡减少；损伤后1h激动自噬，神经元凋亡增加。第四部分Homer1a对神经元机械性损伤后自噬的调节作用及机制目的探索Homer1a对神经元机械性损伤后自噬的调节作用及机制。方法（1）Homer1a调节：构建Homer1a过表达和干涉载体，通过慢病毒转染来上调和下调Homer1a表达；（2）自噬的干预：使用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA干预自噬；（3）抑制PI3K-Akt信号通路：使用浓度为25μM的PI3K抑制剂LY294002预处理；（4）分子表达：采用Western blot检测活化Homer1a、p-Akt、T-Akt、LC3Ⅱ和Beclin-1的表达。结果皮层神经元机械性损伤后1h Homer1a蛋白表达开始增加，6h为表达高峰，之后趋于下降；免疫荧光法检测可见，损伤后6h Homer1a蛋白在神经元上表达显著高于对照组，主要分布于胞质的胞膜侧和突起。过表达Homer1a可使损伤后神经元p-Akt表达降低，同时LC3Ⅱ和Beclin-1表达升高，细胞活性改善；干涉Homer1a可使损伤后神经元p-Akt表达升高，LC3Ⅱ和Beclin-1表达降低，细胞活性降低。使用LY294002抑制PI3K，损伤神经元Homer1a蛋白表达上调；使用3-MA抑制自噬，损伤神经元Homer1a蛋白表达下调，使用雷帕霉素激动自噬，损伤神经元Homer1a蛋白表达上调。结论Homer1a通过PI3K/Akt信号通路调节神经元机械性损伤诱导的自噬；神经元机械性损伤诱导的自噬对Homer1a蛋白有正反馈调节作用。