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利用脂质体转染技术将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)前病毒全基因组cDNA克隆质粒DNA(pPB101)转染鸡胚成纤维细胞,以针对REV的单克隆抗体和REV envgp90原核表达产物免疫小鼠制备的多抗血清分别对分子克隆化病毒感染的细胞作间接免疫荧光反应,并用PCR的方法对感染后的细胞基因组进行检测,均表明获得了具有传染性的病毒,该结果说明重组质粒pPB101具有感染性。 对SNV株前病毒全基因组cDNA克隆进行酶切,将酶切产物分别克隆进pUC18中,分别将各个亚克隆进行测序,按照酶切位点和已知的部分序列以及REV物理图谱将测得的序列进行拼接,完成了REV全基因组序列。通过检索,发现该全基因组序列为国际首先报道,填补了REV基因组的空白,为今后研究REV的特性及对REV的防治奠定了基础。 根据网状内皮增生症病毒SNV株env基因的序列,设计并且合成了两对引物,利用该引物,以中国地方分离株SD9901、HA9901前病毒基因组cDNA为模板,通过PCR技术,成功的从国内分离得两株REV毒株中扩增出env基因,并将之克隆进pUCm-T载体中测序。将所得得序列与SNV株进行比较,分析其基因同源性。结果发现,在核苷酸水平上,参考株SNV env基因与两株中国分离株的同源性分别为97.7%和95%,而在氨基酸水平上,其同源性为96.9%和92.7%。从进化关系看,HA9901的变异相对较大。 根据禽网状内皮组织增生症病毒属鸭脾坏死病毒株(SNV)的序列,设计并且合成一对引物,以SNV株前病毒cDNA全基因组克隆为模板,通过PCR技术,扩增出该病毒囊膜糖蛋白(env)基因gp90部分;将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷光甘肽-S-转移酶(GST)的下游;将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在37℃、1.0mMIPTG诱导下,gp90基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实其表达的融合蛋白的大小为64KD。将表达产物回收后免疫小鼠,所得的抗血清可与REV毒株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)在免疫荧光试验中起反应。这表明,体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。 本研究在国际上首先完成了REV全基因组序列的测定;通过将REV全基因组克隆转染,获得了具有感染性的活病毒,为REV载体的研究和利用该分子克隆化病毒体外研究REV的变异奠定了基础;在国内首先完成了中国地方分离株env基因的序列比较,绘制其进化树,显示了不同毒株的进化关系;利用pGEX表达载体对REVenvgp90基因进行了体外表达。所有这一切都为以后进一步研究REV奠定了基础。