三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)是一种慢性口面部神经病理痛,通常累及三叉神经一支或几支感觉神经的分布区,反复发作,且以阵发性、电击样痛为特征。截止目前,临床原发性TN的病因和发病机制尚未阐明,仍缺乏有效的镇痛药物。TN发作时,三叉神经感觉传导通路上各级神经元的兴奋性均提高,并且阈值降低,导致神经元被轻微刺激或不被刺激时,也会出现阵发性大幅度放电,异常放电传入中枢后引起剧烈疼痛。三叉神经脊束核尾侧亚核(trigeminal caudal subnucleus,Vc)是口面部伤害性信息传导通路的第二级神经元所在,传递口面部伤害性信息的薄髓A_&纤维和无髓C纤维主要终止于Vc的浅层(I/Ⅱ层)。源于脑干的下行抑制系统也主要终止于Vc的浅层,因此,Vc是口面部伤害性信息传递及对这些信息进行整合的关键核团。近年来不管是临床还是基础研究都强烈表明岛叶皮质(inslar cortex,IC)在疼痛处理过程中的重要性。电刺激患者后部岛叶引发疼痛。因胶质瘤或脑卒中累及岛叶的患者,手术切除此区后会出现痛觉减退甚至消失。损毁大鼠双侧岛叶可明显缓解炎性痛和神经病理痛,均提示岛叶有致痛作用。然而,岛叶处理疼痛的部位和参与疼痛调控的确切机制仍不清楚。根据细胞构筑,岛叶划分为颗粒皮质(granular insular cortex,GI)、少颗粒皮质(dysgranular insular cortex,DI)和无颗粒皮质(agranular insular cortex,AI)。慢性坐骨神经压迫损伤(chronic constriction injury,CCI)模型术前或术后损毁尾侧岛叶颗粒皮质(caudal granular insular cortex,CGIC)可长期减轻大鼠的痛觉超敏,而不影响机械痛阈,电生理学结果显示可能是由皮质脊髓通路完成的。形态学研究显示岛叶的DI在前连合交叉层面可直接发出纤维投射到对侧Vc,观察到Vc的背内侧部直接接收对侧岛叶GI和DI的投射,这意味着岛叶可直接下行投射到Vc参与口面部伤害性信息的处理。此外,国际疼痛研究协会(IASP)将慢性痛定义为“超过正常的组织愈合时间的疼痛”,正常的组织愈合时间通常为三个月,换句话说,引起伤害性刺激的损伤已经愈合,但疼痛依然存在,演变为一种不愉快的主观感觉和情绪体验,常伴有强烈的负性情绪(如厌恶、焦虑、抑郁等)。岛叶与感觉皮层、杏仁核、前额叶皮质等边缘系统相互联系,使得传入的伤害性感受信息与情感、记忆、注意等在岛叶进行整合,因此,岛叶不仅参与疼痛的感觉成分,还参与疼痛伴随的情绪成分。最近的研究表明,胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)在神经可塑性事件中,例如长时程增强、学习、记忆以及疼痛的中枢敏化,均发挥了重要的作用。其中,疼痛的中枢敏化是产生和维持慢性痛的重要生物学机制。文献显示炎性痛或神经病理痛状态下,ERK在前额叶皮质内侧、前扣带回、杏仁核以及岛叶等高级中枢被激活。例如,切口痛早期,前扣带回内的磷酸化ERK(p-ERK)与机械性痛敏和焦虑样行为的产生均有关,但在晚期,p-ERK的表达仅与焦虑样行为的维持有关。U0126是ERK特异性上游激酶的抑制剂,可阻断上游激酶对ERK的磷酸化激活,并抑制p-ERK介导的短期和长期的神经可塑性改变。因此,本课题拟利用U0126研究岛叶的ERK通路是否参与口面部痛感觉和痛情绪的调控。脊髓的感觉信息传递(包括伤害性感受信息的传递)可被脊髓上中枢双重(抑制或易化)调控。岛叶直接下行投射到Vc,表明Vc中传递伤害性信息的神经元不仅可以被外周伤害性信息激活,还可以被岛叶投射神经元调控。因此,本研究推测口面部痛大鼠岛叶的ERK通路激活,介导下行投射到Vc的神经通路发生可塑性改变,易化Vc神经元的作用,放大向上的感觉信息传递,导致口面部痛敏。利用U0126抑制三叉神经痛大鼠岛叶ERK通路的激活,对口面部痛行为的改善,对岛叶投射到Vc的神经元电生理方面的影响,以及对Vc神经元活化的影响,将揭示岛叶-三叉神经脊束核下行通路参与口面部痛的机制。材料与方法1.将顺行示踪剂植物凝集素(Phaseolusvulgaris-leukoagglutinin,PHA-L)用电泳法分别注入岛叶前部和岛叶后部,观察岛叶的投射纤维分布。为了证实在Vc观察到的神经纤维是源于岛叶皮质的直接下行投射,将逆行示踪剂荧光金(Fluoro-Gold,FG)分别注射到Vc的背内侧部和腹外侧部的浅层(I/II层),观察被FG逆行标记的神经元在岛叶的分布情况。2.建立眶下神经慢性缩窄环术(chronic constriction injury of the infraorbital nerve,IoN-CCI)三叉神经痛大鼠模型,检测大鼠口面部机械性刺激反应阈值(50%head withdrawal threshold,50%HWT)和口面部单侧不对称理毛次数评估大鼠口面部的机械性痛敏和口面部自发痛。采用高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)和旷场实验(open field,OF)评估大鼠的焦虑/抑郁样负性情绪。3.采用免疫组织化学染色和Western blot方法检测ERK信号通路分子ERK和CREB在IoN-CCI术后岛叶的表达变化。反之,岛叶微注射U0126,阻断ERK通路的磷酸化激活,采用之前的行为学检测方法再次观察三叉神经痛大鼠机械性痛敏和自发痛以及痛相关的焦虑/抑郁样情绪是否得到改善。4.采用电生理和束路示踪结合的方法,先将四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine,TMR)注射到大鼠Vc的浅层以标记投射到Vc的岛叶神经元,再培养IoN-CCI大鼠的离体脑片,钳制岛叶处TMR标记的神经元,电生理记录U0126对IC-Vc投射神经元自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)以及固有兴奋性的影响。最后,采用免疫荧光染色法观察岛叶ERK通路激活的改变对靶区Vc处Fos阳性神经元数量的影响。结果1.将顺行示踪剂PHA-L分别注入岛叶前部和岛叶后部,可见锥体束、对侧中缝大核、对侧Vc的浅层(I/II层)和深层(III-V层)、对侧孤束核均有PHA-L顺标的纤维和终末。同侧基底外侧杏仁核、同侧下丘脑外侧区、中缝背核、伏核中央部、丘脑中线核群的中央内侧核、丘脑腹后核小细胞部均有PHA-L顺标的纤维和终末。没有在三叉神经脊束核吻侧亚核和极间亚核(Vi和Vo)处观察到标记的纤维和终末。将逆标示踪剂FG分别注射到Vc的背内侧部和腹外侧部的浅层(I/II层),分别在吻侧岛叶的GI/DI(前囟前3.0 mm到前囟后1.0 mm)和尾侧GI/DI(前囟到前囟后2.0 mm)处产生了FG逆标的锥体细胞带,AI处没有。2.IoN-CCI手术降低了大鼠的口面部机械性刺激反应阈值,痛阈降低持续至少3 w,术后14 d达最低值。检测反映自发痛的面部不对称理毛行为显示:IoN-CCI术后3~21 d大鼠的面部不对称理毛次数与假手术(Sham)组相比明显增加。旷场实验中,IoN-CCI组大鼠的中央区活动时间占总时间百分比(center time%)与Sham组相比明显降低。高架十字迷宫实验中,IoN-CCI组大鼠进入开放臂的次数占总次数百分比(OA entries%)明显低于Sham组,在开放臂活动时间占总时间百分比(OA time%)比Sham组大鼠明显减少。3.与Sham组大鼠相比,三叉神经痛大鼠岛叶p-ERK阳性的神经元数量在IoN-CCI术后3~21 d明显增加,岛叶的浅层(II/III层)和深层(V/VI层)均有分布,p-ERK的表达明显分布于神经元的顶树突,尤其是IoN-CCI术后21d(神经病理痛晚期)。Western blot方法检测了岛叶ERK信号通路分子ERK和CREB的表达,与空白对照(Na?ve)组大鼠相比,p-ERK和磷酸化的CREB(p-CREB)的表达在Sham组大鼠的岛叶无明显改变,在IoN-CCI术后3 d明显升高,持续升高至少3 w。总ERK(t-ERK)和总CREB(t-CREB)的量在各组间均无明显改变。4.IoN-CCI术后14 d,岛叶内微注射U0126(CCI+U0126)后1 h,与注射vehicle(CCI+Veh)相比,明显抑制了岛叶p-ERK和下游分子p-CREB的升高。t-ERK和t-CREB的量在所有组间均无明显差异。与CCI+Veh组相比,CCI+U0126组大鼠的50%HWT明显增加,自发面部理毛次数显著减少。旷场实验与高架十字迷宫实验测试中,与CCI+Veh组相比,CCI+U0126组大鼠的center time%显著增加,OA entries%和OA time%均明显增多。5.电生理记录三叉神经痛大鼠岛叶投射到Vc的神经元(IC-Vc投射神经元)显示:与灌流vehicle相比,U0126明显减少了IC-Vc投射神经元sEPSCs的频率和幅度,明显增加了配对脉冲比率。给予三叉神经痛大鼠IC-Vc投射神经元外源性电流刺激,与vehicle相比,U0126使得神经元动作电位的发放数目明显减少。岛叶微注射U0126与注射vehicle相比,三叉神经痛大鼠Vc区Fos阳性神经元的数量明显减少。结论1.接受口面部伤害性信息的Vc浅层,还接受岛叶GI和DI的双侧投射,对侧占优势,但没有来自AI的投射。吻侧GI/DI和尾侧GI/DI分别投向Vc浅层的背内侧部和腹外侧部。岛叶还投射到杏仁核、孤束核、伏核和脑干等区域。暗示了Vc在处理口面部伤害性信息时,还直接受GI和DI调控,但不直接受AI影响。2.IoN-CCI三叉神经痛大鼠岛叶的ERK通路激活,给予U0126抑制岛叶ERK通路的激活不仅缓解了IoN-CCI引起的口面部机械性痛敏和自发痛,而且改善了IoN-CCI大鼠的焦虑/抑郁样负性情绪。证实大鼠岛叶的ERK通路参与了口面部痛感觉和痛情绪的调控。3.抑制三叉神经痛大鼠岛叶的ERK通路,通过突触前和突触后两种机制减弱了IC-Vc投射神经元的自发放电和固有兴奋性,直接抑制了靶区Vc神经元的激活,缓解了口面部痛敏和痛情绪。