前言：　　遗传性对称性色素异常症(Dyschromatosis Symmetrica Hereditaria，DSH，OMIM:127400)又称对称性肢端色素沉着(symmetric dyschromatosis of theextremities)或Dohi对称性网状肢端色素沉着(symmetric or reticulateacropigmentation of Dohi)，是一种常染色体显性遗传性皮肤病。主要临床特征为手足背部的对称性色素沉着及色素减退斑，部分患者面部可有雀斑样损害。通常自幼年发病，青春期停止发展，并保持终生。色素沉着可因日晒而加重，患者一般无自觉症状。本病主要见于日本和中国人群。2003年，该病的致病基因被Miyamura等确定为1q21.3区的ADAR1，此后，越来越多的ADAR1基因突变在DSH患者中被鉴定出来。但是，ADAR1基因突变导致DSH发生的机制仍不清楚。　　黑素的合成是酪氨酸经过一连串的化学反应实现的，酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是其中最关键的酶。黑素小体从生成到成熟大约经历四个阶段，涉及的关键基因主要是前黑素小体蛋白17(Pre-melanosomal protein17，PMEL17)。黑素小体成熟后由黑素细胞转运到角质细胞，这个阶段最主要的调节基因为Ras蛋白家族成员RAB27A，它参与组成的蛋白复合体是黑素小体转运到黑素细胞轴突的所必需的。DSH患者皮肤外观及病理表型提示我们，皮肤患处黑素合成、黑素小体生成及转运出现异常，而参与这些过程的相关基因表达也可能发生改变。根据文献，这些基因都有一个共同的上游调控转录因子——小眼畸形相关转录因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）。如果黑素合成、黑素小体生成及转运相关基因表达都发生改变，并且表达同时上升或下降，则提示我们MITF基因的表达异常。　　ADAR1基因突变在DSH患者中主要表现为黑素合成与分布的异常，而黑素合成通路中几乎所有的相关基因均受转录因子MITF的调控。因此，探讨ADAR1蛋白与黑素合成通路中关键的上游基因MITF之间是否存在调控关系可能为DSH的发病机制提供线索。前期，我们收集了1个较大的DSH家系以及4个散发病例。为探讨ADAR1基因突变引起DSH的致病机制，本研究拟(1)培养小鼠黑素细胞(Melan-a)，应用RNAi技术沉默Adar1基因表达，检测黑素合成、黑素小体生成及转运相关基因Tyr、Pmel17、Rab27a及Mitf的mRNA表达和Mitf蛋白表达;(2)筛查DSH患者及其家系成员的ADAR1基因突变，并分析突变型及野生型ADAR1蛋白空间结构差异;(3)构建突变型ADAR1基因表达载体，转染人黑色素瘤细胞系(A375)，检测黑素合成通路中MITF基因mRNA及蛋白表达水平和酪氨酸酶活性，以验证突变蛋白的功能。　　材料与方法：　　1、标本及细胞系　　收集DSH患者及家系成员的外周血样及对照血样。所有患者均签署知情同意书。　　小鼠源性黑素细胞(Melan-a)及人黑色素瘤细胞(A375)及均由中国医科大学附属第一医院皮肤科徐学刚医生惠赠。　　2、实验方法　　(1)合成小鼠Adar1基因特异性siRNA，转染Melan-a细胞，应用Real-timePCR检测Aadr1基因、黑素生成相关基因Tyr、Pmel17、Rab27a和Mitf基因的mRNA表达水平，用Western-blot检测Adar1及Mitf蛋白表达水平;　　(2)合成小鼠Mitf基因过表达质粒，与Adar1基因特异性siRNA共转染Melan-a细胞;用Real-time PCR检测黑素生成相关基因Tyr、Pmel17、Rab27a的mRNA表达情况;　　(3)用PCR结合测序的方法筛查DSH家系患者及成员ADAR1基因15个外显子及外显子-内含子交界区的突变;　　(4)提取患者及家系成员外周血mRNA，进行反转录，之后用PCR结合测序的方法检测患者ADAR1基因mRNA第12外显子是否存在缺失;　　(5)应用在线生物信息学软件SWISS-MODEL Workspace预测野生型与突变ADAR1蛋白的结构差异;　　(6)根据发现的突变，构建突变型ADAR1基因表达载体，转染A375细胞，应用Real-time PCR和Western-blot方法检测ADAR1基因和MITF基因mRNA及蛋白表达水平，并检测细胞中酪氨酸酶的活性。　　实验结果：　　1、抑制Melan-a细胞的Adar1基因后，黑素生成相关基因Mitf、 Tyr、Pmel17、Rab27a mRNA表达水平下降，Mitf蛋白表达下降;　　2、共转染Mitf表达质粒及Adar1基因siRNA后，黑素生成相关基因Tyr、Pmel17、Rab27a mRNA表达水平上升;　　3、对DSH家系及散发病例进行突变筛查后，发现ADAR1基因两个新突变，其中一个位于第11内含子的剪接受体(IVS12-2 A＞T)，另一个位于第12外显子内(p.1051A＞V)，在家系中正常成员及100例正常对照中均未发现相同突变;　　4、检测患者ADAR1基因mRNA，发现IVS12-2 A＞T剪接位点突变导致患者ADAR1基因mRNA第12外显子杂合缺失;　　5、对突变c.3152C＞T进行生物信息学分析，结果提示野生型与突变型ADAR1蛋白结构存在明显差异;　　6、将两种突变型ADAR1基因表达载体转染A375细胞后，发现细胞中MITF基因mRNA及蛋白表达均下降，酪氨酸酶活性下降。　　结论：　　1、在小鼠源性黑素细胞Melan-a中证实Adar1基因对黑素合成通路中关键基因Mitf存在调控作用;　　2、在一个DSH家系及一个散发病例中分别发现了ADAR1基因的新突变，可影响ADAR1蛋白的功能。