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背景:神经病理性疼痛定义为躯体感觉系统的损害或者疾病导致的疼痛,这种疾病对病人的生活和健康都造成了严重的影响。但是,神经病理性疼痛的机制仍不清楚,并且缺乏有效的治疗药物。Mrgs(Mas-relatedgenes)相关受体是一类与疼痛密切相关的新型G蛋白親联受体(G-Protein coupled receptor,GPCR),MrgprD是其中的一种亚型,在疼痛的感受和调节中起着重要的作用。过去的研究认为G蛋白耦联受体和TRP通道一起参与了炎性反应。所以我们推测MrgprD参与了神经病理性疼痛。由此,我们开展了 MrgprD是否参与神经病理性疼痛及其下游TRP通路的研究。目的:1.探究MrgprD是否参与神经病理性疼痛;2.寻找MrgprD介导神经病理疼痛的下游通路。方法:(1)野生型(WT)小鼠与 MrgprD-/-小鼠 CCI(chronic constriction injury,坐骨神经慢性压迫模型)造模,通过小鼠疼痛行为学实验,检测小鼠机械痛,冷痛和热痛的差异,从整体行为学来判断MrgprD是否参与了神经病理性疼痛的产生。(2)通过免疫荧光化学染色检测MrgprD-/-小鼠(MrgprD被GFP-green fluorescent protein替代)对照组,假手术组和CCI造模组L4的DRG(dorsal root ganglion)神经元上的MrgprD的表达;通过Realtime-PCR观察WT小鼠在CCI造模后的MrgprD的mRNA水平的变化;钙成像实验测定CCI模型小鼠DRG神经元和MrgprD特异性激动剂β-alanine的反应。(3)钙成像观察MrgprD激动剂β-alanine 与 TRPA1(transient receptor potential A1)激动剂-芥子油(mustard oil)和DRG神经元的共反应;免疫荧光化学双染的方法检测MrgprD和TRPA1在DRG神经元的共表达情况,从形态学上确定DRG神经元MrgprD和TRPA1之间的关系。(4)钙成像的方法检测TRPA1阻断剂HC-030031是否抑制了 β-alanine引起DRG神经元钙的内流;电生理实验检测了 HC-030031是否抑制了 β-alanine所诱导的内向电流。(5)为了进一步验证MrgprD和TRPA1的关系,我们用钙成像的方法比较了 WT和TRPA1-/-产小鼠的DRG神经元和β-alanine的反应。同时也观察WT小鼠和MrgprD-/-小鼠的DRG神经元和TRPA1激动剂mustard oil的反应。(6)转染MrgprD和TRPA1质粒的HEK293细胞和β-alanine反应验证TRPA1和MrgprD之间的关系。(7)一般认为G蛋白耦联受体下游通过PKA(protein kinase A)、PKC(protein kinase C)或PLC介导信号的传递,我们使用了 PKA和PKC以及PLC的抑制剂通过钙成像实验确定MrgprD的下游通路。(8)过去的研究中,在小鼠的皮下注射药物β-alanine,使MrgprD激活后可引起瘙痒行为。我们通过足底皮下注射β-alanine观察CCI模型下痛觉(舔足的行为)和痒觉(咬足的行为)的变化。结果:(1)CCI造模后,与WT小鼠相比,MrgprD-/-小鼠第7天开始机械痛行为和冷痛行为都出现了明显的差异,但是热痛没有差异,表明MrgprD参与神经病理性疼痛的机械痛与冷痛的产生。(2)免疫荧光化学实验发现CCI造模组小鼠MrgprD阳性神经元表达明显增多。Realtime-PCR检测发现CCI组小鼠MrgprD表达与对照组相比mRNA水平明显增加。钙成像实验发现CCI手术组小鼠DRG神经元对β-alanine的反应明显高于对照组。(3)钙成像实验发现β-alanine激活的DRG神经元都可被mustard oil激活,免疫荧光化学实验发现MrgprD阳性的神经元大部分表达TRPA1。(4)钙成像结果显示TRPA1抑制剂HC-030031明显的抑制了 β-alanine所诱发的钙的内流。全细胞膜片钳实验证实TRPA1抑制剂HC-030031明显抑制了 β-alanine所诱导的内向电流。(5)和WT小鼠相比较,TRPA1-/-小鼠DRG神经元和β-alanine的反应大小和细胞数都明显下降;但是MrgprD-/-小鼠DRG神经元和TRPA1激动剂mustard oil的反应与WT小鼠相比没有任何差异。(6)共转染MrgprD和TRPA1的HEK293细胞和β-alanine的反应与只转染MrgprD的HEK293细胞相比,反应大小明显增强。β-alanine不能和未转染质粒的HEK293细胞发生反应。(7)PKA的抑制剂明显抑制了 β-alanine激活DRG神经元引起的钙内流,PKC、PLC阻断剂的抑制作用不明显。同时在共转染MrgprD和TRPA1的HEK293细胞上,PKA的阻断剂也明显的抑制了β-alanine激活MrgprD所引起的钙内流。我们检测到β-alanine激活DRG神经元引起TRPA1磷酸化,这种磷酸化可以被PKA的阻断剂所抑制。(8)β-alanine足底注射同时可以引起痛和痒的表现,但在CCI模型下,痛觉出现明显的增强,而痒觉没有变化。在神经病理性疼痛的条件下,MrgprD-/-小鼠和WT小鼠相比痛觉明显的下降。TRPA1-/-小鼠与WT小鼠相比,β-alanine足底注射引起的疼痛行为下降,但在CCI模型下TRPA1-/-小鼠疼痛行为下降更为明显。结论:MrgprD作为Mrgs家族的一员参与了神经病理性疼痛的产生,我们进一步发现MrgprD主要通过PKA-TRPA1途径参与神经病理性疼痛的产生。在神经病理性疼痛的条件下,β-alanine主要引起疼痛的行为。研究意义:MrgprD参与神经病理性疼痛的研究阐述了神经病理性疼痛产生的新机制,为开发相关镇痛药物提供了新的作用靶点。