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牛肉风味强化肽(Beefy Meaty Peptide, BMP)最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽。经研究分析证明,BMP与食盐、味精有较好的协同呈味作用,能增强牛肉风味,并且具有良好的热稳定性,可以满足食品工业生产的热处理要求。因此BMP有潜力成为新一代风味强化剂。本课题在实验室已构建的BMP组成型表达载体pGAP9-16BMP,并在毕赤酵母Pichia pastoris GS115 (pGAP9-16BMP)中成功表达BMP基础上,采用基因工程方法在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中组成型表达BMP,利用酿酒酵母代替毕赤酵母作为宿主菌,以食品级菌株作为宿主菌,保证了表达产物的安全性。以工程菌Pichia pastoris GS115 (pGAP9-16BMP)基因组DNA为模板PCR扩增PGAP-16BMP,以S. cerevisiae基因组为模板PCR扩增终止子CYC1,并将扩增得到的产物克隆于YEp352质粒上,构建成组成型表达载体YEp352-16BMP。将质粒YEp352-16BMP经醋酸锂法转化到S.cerevisiae W303-1A中,最终通过尿嘧啶营养缺陷型平板筛选和进一步的PCR验证,得到能够分泌表达16BMP的酿酒酵母工程菌W303-1A (YEp352-16BMP)。优化工程菌W303-1A (YEp352-16BMP)摇瓶发酵培养条件。通过单因素实验,找出影响作用较大的三个因素为葡萄糖、YP浓度和培养基初始pH值。通过正交试验选择出了最佳的摇瓶发酵条件水平组合：即葡萄糖浓度为3%(w/v),YP浓度为1.5×,初始pH为5.0。经过优化后,30℃发酵48 h时,BMP在摇瓶水平获得最高表达量可达190 mg/L。在5L发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵优化酿酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)组成型表达BMP。分批发酵时,发酵液金BMP在36h时获得最大表达量为180mg/L。补料分批发酵时,采用分别在发酵至12 h、15h、18h、21h、24 h时恒速流加8g/L葡萄糖溶液,总糖质量浓度为70g/L的补料策略,在发酵48h时,菌体数目比分批发酵时提高了近一倍,BMP在36h时获得最高表达量为253 mg/L。发酵液经过煮沸,离心取上清,先通过截留分子量为60 kDa的中空纤维进行初步纯化,经截留分子量为6000 Da的中空纤维进行浓缩纯化,最后将3.5 L发酵上清液浓缩为350 mL。初步分离纯化得到了16拷贝的BMP目的产物。