论文部分内容阅读
目的:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)为原发性肝癌最常见类型,为消化系统常见的恶性肿瘤,全球范围内,HCC在恶性肿瘤中发病率居第六位,也是导致癌症相关死亡的第三大原因。近年来,全球范围内糖尿病患病率迅速增加,我国成人糖尿病患病率已达10.9%。有研究表明,糖尿病促进了HCC的进展,使患者预后更差、生存期缩短,糖尿病不仅是肝癌的独立危险因素,更是增加了肝癌的死亡率,但糖尿病与肝癌之间具体的内在联系机制尚未明确。本课题组前期实验从不同糖浓度(5.5mmol/L、25mmol/L)干预的人肝癌细胞系HepG2细胞中提取出内质网,后经过蛋白组学方法对内质网进行质谱分析,从而得到不同糖浓度下表达差异明显的内质网蛋白ERP29,初步证实了LncRNA MEG3-mi R483-3p-ERP29的调控网络影响HepG2细胞的作用机制,本研究在前期实验基础上,进一步探讨高糖在转录水平调控LncRNA MEG3表达的分子机制,并在临床病理标本中(肝癌合并糖尿病与单纯肝癌)进一步验证转录因子ESR1与LncRNA MEG3的表达以及二者与肝癌合并糖尿病患者肿瘤生物学行为和预后的相关性,为今后肝癌合并糖尿病患者的治疗提供可能的干预靶点。方法:1.通过PROMO、Jaspar网站预测LncRNA MEG3可能的转录因子,结合GEPIA数据库检索,筛选得到候选转录因子。2.体外实验:培养人肝癌细胞系HepG2细胞,在不同糖浓度干预条件下,通过RT-qPCR和Western Blotting等实验技术对候选转录因子的表达水平进行检测。3.以HepG2细胞为研究对象,采用不同的糖浓度进行处理,观察高糖对转录因子ESR1表达以及肿瘤细胞增殖等生物学行为的影响;采用细胞瞬时转染技术,过表达转录因子ESR1,观察高糖状态下HepG2细胞增殖、迁移能力是否受到抑制,通过si RNA瞬时转染技术敲减ESR1,探讨HepG2细胞的增殖与迁移能力是否得到促进;并进一步采用RT-qPCR技术,检测转录因子ESR1对下游LncRNA MEG3的表达影响;进行挽救实验,探索ESR1是否依赖LncRNA MEG3转录调控途径影响HepG2细胞生物学行为。4.临床研究:收集于天津市第一中心医院肝胆外科2016年3月-2019年7月间新发的单纯肝细胞癌患者和肝癌合并糖尿病患者的肝癌组织及其对应的癌旁组织标本,并采集所有患者病史和临床资料。分析两组患者肿瘤临床病理特点,应用RT-qPCR方法检测两组患者肝细胞癌组织中转录因子ESR1和LncRNA MEG3的表达差异,以及二者的相关性,并进一步分析转录因子ESR1和LncRNA MEG3分别于肿瘤相关参数之间的相关性。采用生物信息学技术,分析并验证ESR1与LncRNA MEG3的表达量对患者生存预后的影响。结果:1.通过PROMO及Jaspar网站预测可能的上游转录因子,利用GEPIA数据库,结合RT-qPCR及Western Blotting实验技术,筛选转录因子ESR1。2.体外培养HepG2细胞,高糖条件下过表达ESR1,细胞增殖与迁移能力下降;高糖条件下低表达ESR1后,细胞增殖与迁移能力则明显增加。3.体外培养HepG2细胞,分别过表达与敲减ESR1后,LncRNA MEG3的表达水平也相应增多与降低。挽救实验证实ESR1通过LncRNA MEG3调控HepG2细胞增殖与迁移。4.临床研究提示:肝细胞癌合并糖尿病患者较单纯肝细胞癌患者AFP和CA-199数值更高、肿瘤数量更多、TNM分期和埃德蒙森分级更差;肝癌组织标本中,转录因子ESR1和LncRNA MEG3的表达水平的降低程度与糖尿病和埃德蒙森分级相关。5.生物信息学分析,在HCC组织中,转录因子ESR1与lnc RNA MEG3低表达的HCC患者生存期显著缩短。结论:高糖通过抑制转录因子ESR1的表达,从而影响了其转录调控的下游靶基因LncRNA MEG3在HepG2细胞中的表达,进而促进了HepG2细胞的增殖与迁移能力。转录因子ESR1和LncRNA MEG3对糖尿病合并肝癌患者的预后和生存期起着重要作用,ESR1转录调控MEG3途径有望成为HCC合并糖尿病治疗的一个新的干预靶点。