目的:系统性红斑狼疮（ systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及全身多系统的自身免疫性疾病。狼疮性肾炎（Lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮所致的脏器合并症中发生率最高的疾病,最终发展为肾功能衰竭而危及生命。因此探讨LN的发病机制、寻找有效的治疗措施,对于改善患者生存质量,具有十分重要的意义。LN常见的病理特征是系膜细胞和系膜基质增生,并伴有明显的淋巴细胞、单核细胞浸润。近年来研究发现,细胞因子在LN的发生和发展过程中起着重要的作用,致炎细胞因子和抗炎细胞因子之间失衡的程度决定了炎症的严重性和范围。高迁移率族蛋白1（high mobility group protein box 1, HMGB 1）是一种参与细胞核内多种生物学功能的核内蛋白,最新的研究发现它是一种新型的炎性细胞因子。HMGB1能够激活和趋化炎症细胞,诱导大量细胞因子的分泌。同时,HMGBl还是一种内源性的免疫辅剂,是树突状细胞成熟和Thl细胞极化过程中的一个调节因子,对于维持Thl和Th2细胞因子之间的平衡有着重要作用。以往的研究已经证实,HMGB1和多种自身免疫性疾病相关,并已成为关节炎治疗的靶向。但其在LN发病过程中是否起作用及其可能的作用机制尚不清楚。因此,本试验从临床病例资料和细胞培养两个方面,采用多种实验技术研究HMGB1在LN发病中的作用,并通过观察TLR/STAT信号转导基因的表达变化,探讨HMGB1在LN中可能的作用机制,为LN的治疗提供新的治疗策略和实验依据。方法:1狼疮性肾炎患者外周血中HMGB1水平的检测选取河北医科大学第二医院免疫风湿科门诊及住院SLE患者34例,均符合1987年美国风湿病学会（American College of Rheumatology,ACR）SLE的诊断标准。其中没有肾脏损害者16例（SLE组）,合并肾脏损害者18例（LN组）,与上述34例患者性别年龄相匹配的健康志愿者12例作为健康对照组。所有入组人群均无吸烟史及合并肿瘤和感染性疾病,以上患者和志愿者均征得本人同意并签订了知情同意书。采用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中HMGB1的浓度;反转录-多聚酶链反应（reverse transcriptase-polymerse chain reaction,RT-PCR）检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中HMGB1 mRNA的表达;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）在PBMC中的表达变化;同时记录相应的临床和实验室指标。2人肾小球系膜细胞体外培养及增殖状态检测取生长良好的处于对数生长期的人肾小球系膜细胞（为本教研室所保藏）,用2.5g.L-1胰蛋白酶消化,按1×104个孔-1接种于6孔板和100ml的培养瓶中,同步后加入含10μg.L^-1重组人HMGB1的培养基刺激细胞。继续孵育6h、12h、24h,以上述3个时间点为标准将HMGB1刺激后细胞分为3组,每组重复设6个实验样本。收集细胞,免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）检测系膜细胞增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达;免疫细胞化学和FCM检测系膜细胞TLR2蛋白的表达;RT-PCR检测STAT1 mRNA及STAT3 mRNA的表达。结果:1 HMGB1 mRNA和蛋白在LN患者外周血中的表达变化（1）PBMC中HMGB1 mRNA的表达RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳结果表明:SLE组患者HMGB1 mRNA相对表达量与健康对照组相比无显著性差异,而LN组患者HMGB1 mRNA相对表达量均高于健康对照组和SLE组（P<0.01）。（2）血清中HMGB1蛋白的表达变化LN组血清HMGB1蛋白的表达水平[（9.79±1.76）mg/ml]明显高于健康对照组[（7.79±0.75）mg/ml] （P<0.01）和SLE组[（7.55±1.67） mg/ml] （P<0.01）;SLE组和健康对照组之间差异无统计学意义。（3）TLR4在PBMC中的表达变化新鲜血直接免疫荧光流式细胞术显示CD14⁺的单核细胞表面HMGB1受体TLR4在狼疮性肾炎组表达最高（P< 0.01）,而CD3⁺的淋巴细胞表面HMGB1受体TLR4表达率在各组间无显著性差异。（4）相关性分析LN患者血清中HMGB 1蛋白表达水平与患者尿蛋白（Proteinuria,Pro）水平呈正相关（r=0.966,P=0.000）;LN组患者外周血中CD14⁺的单核细胞表面HMGB1受体TLR4的表达水平与患者蛋白尿呈正相关（r=0.836,P=0.000）。2重组人HMGB1刺激后体外培养的人肾小球系膜细胞增殖状态及变化（1）人肾小球系膜细胞PCNA表达的变化免疫细胞化学结果显示,PCNA蛋白阳性信号主要定位于系膜细胞核内,正常对照组系膜细胞核内可见阳性表达,阳性表达率为（48.61±1.23）%,HMGB1刺激组阳性表达率升高,24h时阳性表达率为（98.28±1.86）%（P<0.01）,明显高于正常对照组,表明HMGB1能够促进系膜细胞增生。（2）系膜细胞TLR2蛋白表达的变化免疫细胞化学结果显示:TLR2蛋白的阳性信号主要定位于细胞浆和细胞膜,正常对照组几乎没有TLR2蛋白的阳性表达,而HMGB1刺激组其表达增强（P< 0.01）。流式细胞术结果亦显示:与正常对照组相比,HMGB1刺激6h时TLR2蛋白即有明显的增强,并随着刺激时间的延长,其表达增强（P< 0.01）。（3）系膜细胞STAT信号通路的变化RT-PCR结果显示:HMGB1呈时间依赖性上调STAT1 mRNA的表达,24h表达最高（P< 0.01）。RT-PCR结果显示:HMGB1刺激后,随着刺激时间延长,STAT3 mRNA的相对表达亦逐渐增加,24h表达量最高（P< 0.01）。（4）相关分析人系膜细胞中STAT1 mRNA表达与PCNA阳性表达率、TLR2蛋白表达均呈显著正相关（r=0.817,P=0.000;r=0.830,P=0.000）; STAT3 mRNA表达与PCNA阳性表达率、TLR2蛋白表达亦呈显著正相关（ r=0.863 ,P=0.000;r=0.926,P=0.000）。结论:1 LN患者血清中HMGB1表达水平明显升高;且其表达与患者尿蛋白水平呈正相关,提示HMGBl是狼疮性肾炎发病过程中重要的细胞因子之一。2 HMGB1可能是通过与肾小球系膜细胞表面的TLR2受体结合从而激活STAT蛋白,促进肾小球系膜细胞增殖,进而引起系统性红斑狼疮的肾脏损伤。综上所述,本实验从临床病例资料和细胞培养两个方面进行研究,结果显示:HMGB1在LN发病机制中发挥着重要的作用,是LN治疗中又一个值得关注的新的分子治疗靶点。但是,本研究仅就其在系膜细胞增殖中的作用进行了初步探讨,还需借助于肾活检和实验动物模型对其进行深入的研究和探讨。