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对虾是一种广温广盐性的海产虾类,近年来我国对虾养殖的年产量超过百万吨。对虾养殖产业中细菌性和病毒性疾病严重制约对虾产业的发展。白斑综合症病毒(White spot sydrome virus,WSSV)是养殖对虾爆发性传染疾病的主要病害之一。因此对虾疾病尤其是WSSV的侵染机制成为目前研究的热点,病毒极早期基因在病毒感染宿主的过程中起着关键作用,对其进行研究有助于进一步揭示WSSV的侵染机制,为WSSV的防治提供新思路。本研究工作的内容主要包括以下几部分: (1)构建一系列wsv249的启动子249P-331的连续缺失突变249P-300、249P-275、249P-250、249P-225、249P-200、249P-175、249P-150、249P-130、249P-100,双荧光素酶报告基因检测启动子活性实验表明249P-300启动子活性最高,利用启动子转录因子结合位点软件分析发现其存在2个AP-1家族结合位点;其次,将c-Jun和249P-300、249P-225、249P-200、249P-150分别共转入Sf9细胞,结果表明c-Jun对249P-300的启动子活性有显著性上调作用;最后,对249P-P300启动子上的转录因子结合位点进行单点突变和双突变,实验结果表明c-Jun对249P-300活性上调作用显著性下降。综上所述,本研究找到一个转录因子c-Jun能够显著性上调wsv249启动子活性,为WSSV基因的转录、复制、等过程的研究奠定工作基础。 (2)构建WSV249和WSV403重组质粒及其突变体,转染293T细胞,利用免疫荧光技术和激光共聚焦技术,观察发现野生型均定位在细胞质中并呈点状分布,和γ-Tubulin共定位于中心体,突变体也定位在细胞质中,但无点状分布,和γ-Tubulin无共定位现象;我们用WSSV-CN02株WSSV病毒感染红鳌鳌虾造血组织细胞,运用免疫荧光和激光共聚焦技术,观察发现WSV249和造血组织细胞的γ-Tubulin蛋白共定位于中心体,部分WSV249和细胞骨架蛋白F-actin存在共定位现象。分析泛素连接酶wsv249和wsv403的亚细胞定位对进一步研究它们基因的生物学功能和分子调控机制奠定基础。