论文部分内容阅读
纤维素能被千百种真菌、细菌和放线菌等微生物降解，纤维素酶是生物降解过程中很重要的一组酶，β-1，4-内切纤维素酶是其中必不可少的一类酶，在纤维素的水解过程中随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链末端。
玉米纹枯病已成为我国玉米主产区的一种重要病害，其危害日趋严重。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuthn)是玉米纹枯病的主要致病菌，在活体上可以产生多种胞壁降解酶，以多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和纤维素酶为主。
从田间分离的立枯丝核菌(R.solani AG-1-IA)致病力强。在该菌中未见有β-1，4-内切纤维素酶分离纯化、基因克隆、表达及功能研究的报道。立枯丝核菌在改良的Marcus培养基中产生β-1，4-内切纤维素酶，通过硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水柱层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析等步骤获得了电泳纯的β-1，4-内切纤维素酶。SDS-PAGE确认纯化的酶蛋白分子量约为61.1kDa，最适反应pH值为4.0，最适反应温度为45℃，接种实验表明其对玉米叶片可以产生伤害作用。
根据第12家族糖苷水解酶氨基酸保守区设计引物，克隆到了R.solani的一个β-1，4-内切纤维素酶新基因EGⅢ，并扩增到了该基因的DNA序列，长1067bp，包含三个内含子区域。该基因的cDNA和DNA序列在GenBank中的登录号分别为FJ550135和FJ538292。将EGⅢ与真核表达载体pPIC9K进行体外连接，构建了重组表达载体pPIC9K/eg，用限制性内切酶Sal I线性化后转化巴斯德毕赤酵母获得了酵母工程菌PGS-D，蛋白表达量达0.5 1mg/mL，其最适反应pH为4.0，最适反应温度为55℃，接种实验表明其可以杀死植物细胞。