研究背景经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma, cHL)是组织形态非常特殊的一类淋巴瘤,其肿瘤细胞——H/RS细胞约占肿瘤组织的1/100,该细胞Kuppers等通过单细胞分析和IgH基因重排证实它起源于生发中心残疾B细胞,背景的炎症免疫细胞(包括T细胞、B细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等)及其细胞因子是H/RS细胞赖以生存的基础条件。因此,研究cHL既要注意肿瘤细胞H/RS,还要注重其背景免疫细胞及其细胞因子构成的微环境。H/RS细胞周围微环境的炎症免疫细胞对H/RS细胞的生存是必需的,其炎症免疫细胞以CD4+T淋巴细胞为主,已有证据表明H/RS细胞生存明显依赖其周围细胞释放的生存信号：背景细胞死亡,H/RS细胞消亡。因此,原发肿瘤的H/RS细胞在体外极难培养；HL初发在淋巴结,建立H/RS细胞与背景细胞共同存在的体系,模拟淋巴结内肿瘤状态及生存环境,则是理想的细胞系。但目前均无来自cHL淋巴结的瘤细胞系,且屈指可数的细胞系均来自晚期HL患者的外周血、骨髓或腹水,如L428, L540, L591, DEV, HD-LM2, KM-H2,这些细胞系虽然不能模拟淋巴结内肿瘤状态,但提示H/RS细胞可以离开淋巴结生存；当H/RS细胞转移到其它器官中,背景细胞依然类似淋巴结内病变；H/RS细胞在异种移植的免疫正常小鼠中很难生存(免疫排斥所致),H/RS细胞移植到严重免疫缺陷SCID鼠可以存活与增生,形成移植瘤,但该瘤无cHL的免疫背景细胞,所以目前国际上没有真正体现cHL特点的动物模型。与此同时,cHL必需依赖趋化因子募集免疫背景细胞。本课题组前期经生物信息学分析cHL与弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)趋化因子的差异,发现cHL高表达的趋化因子有RANTES/CCL5、CCL17、CCL22等,在复杂的因子网络关系中RANTES处于较中心的位置,H/RS细胞依赖趋化因子RANTES对CD4+T细胞等背景细胞产生趋化作用。国外和我们前期的实验表明cHL微环境细胞中最显著的是CD4+T细胞,特别是Treg (CD4+ CD25+ FOXP3+T细胞)细胞的重要作用,它和CD4+T细胞一起能抑制cHL微环境中的细胞毒性T淋巴细胞,从而有利于cHL的形成。国外研究表明,cHL的发生、发展和NF-κB活性异常增高有关,我们前期的研究结果表明H/RS细胞为CD99基因低表达和NF-κB信号持续活化。本课题组前期构建的mCD99L2-A20细胞亚系,低表达鼠CD99基因,经鉴定其的确具有H/RS细胞的表型,然而mCD99L2-A20细胞RANTES的表达和NF-κB活性如何?这些方面是否与H/RS相类似?要想完整准确地研究cHL,最可行的就是建立类似人cHL病理特征的活体实验动物模型,满足模拟cHL背景环境的细胞多样性和因子复杂性,从而在此背景微环境基础上才能进行cHL的相关研究,课题组前期将mCD99L2-A20细胞尾静脉注射BALB/c小鼠未能成瘤,所以构建HL动物模型陷入了困境。本研究考虑到cHL为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫缺陷有着密切的关系,糖尿病能降低机体免疫力,有研究证实1型糖尿病并发淋巴瘤的风险较正常人高(男性高8%,女性高12%)。若将来自BALB/c鼠的mCD99L2-A20细胞接种同类糖尿病鼠,既能避免种群排斥,又能避免健康BALB/c鼠的免疫排斥,还能提供处于免疫抑制状态的免疫炎症细胞来源,可以用来成瘤并有助于反应背景细胞的募集。为此,本研究采用荧光定量、共聚集显微镜、免疫细胞与免疫组织化学、ELISA、共培养实验、Western blotting、流式细胞术、体内成瘤的方法,首先观测了cHL细胞及瘤组织的RANTES的表达,探究RANTES在cHL形成中的作用；同时检测RANTES在类人H/RS细胞mCD99L2-A20细胞的表达,进行同源BALB/c糖尿病鼠接种形成移植瘤,以期获得鼠源性的早期类人cHL模型。目的1.观测cHL和DLBCL细胞及瘤组织RANTES的表达的情况,比较分析RANTES在cHL形成中的作用。2.检测HL细胞株L428细胞上调CD99基因前后(L428与L428-CD99)、鼠DLBCL细胞株A20细胞下调CD99基因前后(A20与mCD99L2-A20) RANTES的表达,探究RANTES表达与CD99基因及NF-κB信号通路的关系。3.构建链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导BALB/c小鼠1型糖尿病模型,观测外周血RANTES分泌水平。4.比较mCD99L2-A20类人H/RS细胞株在1型糖尿病BALB/c小鼠和正常BALB/c小鼠中成瘤情况,观测外周血中RANTES分泌水平。方法1.HL和DLBCL中RANTES表达的检测HL细胞株L428与DLBCL细胞株OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10细胞进行细胞培养,观察细胞的形态,提取RNA,荧光定量检测RANTES mRNA的表达,共聚集显微镜检测细胞内RANTES蛋白的表达,免疫细胞化学检测细胞、免疫组织化学检测HL与DLBCL组织的RANTES蛋白表达情况,IPP6.0软件分析阳性细胞光密值数据,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞分泌的RANTES蛋白,共培养实验观测L428分泌的RANTES对CD4+的趋化作用。2. RANTES与CD99、NF-κB信号通路的关系L428与L428-CD99、A20与mCD99L2-A20细胞培养,观察细胞的形态：提取RNA,荧光定量检测CD99mRNA、RANTES mRNA的表达；共聚集显微镜检测细胞内CD99、RANTES蛋白的表达；ELISA检测细胞RANTES蛋白的分泌,Western blotting检测CD99和p-iκBa蛋白的表达。3. BALB/c小鼠1型糖尿病模型的建立及外周血RANTES蛋白的检测将60只雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D四组,每组15只,A组采用一次性腹腔注射150mg/kg STZ, B组采用一次性腹腔注射与A组等量无菌柠檬酸缓冲液,C组采用200 mg/kg STZ分5次腹腔注射,D组采用与C组等量无菌柠檬酸缓冲液分5次腹腔注射,监测不同时点空腹血糖变化,A、B、C、D四组均自由饮食。用流式细胞术检测糖尿病鼠与正常鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞数,ELISA检测糖尿病鼠与正常鼠外周血RANTES蛋白的分泌情况。4.1型糖尿病BALB/c小鼠类HL模型的构建将类人H/RS细胞(mCD99L2-A20细胞)经尾静脉注射接种1型糖尿病BALB/c小鼠和正常BALB/c小鼠各20只,观察动物成瘤时间、成瘤率、瘤体生长速度；取瘤组织做HE染色观察病理学形态、免疫组化检测RANTES的表达；肿瘤组织进行原代培养,DNA-PCR检测载体的整合；流式细胞仪检测成瘤糖尿病鼠与未成瘤糖尿病鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞的比例；ELISA检测成瘤糖尿病鼠与未成瘤糖尿病鼠外周血RANTES蛋白的分泌情况。结果1.HL和DLBCL中RANTES的表达(1)以OCI-Lyl为对照,L428、OCI-Ly8和OCI-Lyl 0细胞的RANTES mRNA表达水平分别是OCI-Lyl的8.154±0.809、0.990±0.062和1.008±0.0565倍,L428细胞中RANTES的mRNA的表达高于OCI-Lyl、OCI-Ly8和OCI-Ly10细胞,两者相比较均有统计学差异(P=0.000); OCI-Lyl与OCI-Ly8 (P=0.959)、OCI-Ly1与OCI-Ly10 (P=0.968)、OCI-Ly8与OCI-Ly10 (P=0.927),两两相比较均无统计学差异。(2)L428细胞中RANTES的表达高于OCI-Ly1、OCI-Ly8或OCI-Ly10细胞,两者相比较均有统计学差异(P=0.000); cHL组织中RANTES的表达高于DLBCL,两者相比较均有统计学差异(P=0.000); cHL组织中RANTES的表达高于L428细胞中的表达,两者相比较均有统计学差异(P=0.000); DLBCL组织中RANTES的表达高于OCI-Ly1、OCI-Ly8或OCI-Ly10细胞中的表达,两者相比较均有统计学差异(P=0.000);OCI-Ly1与OCI-Ly8(P=0.811)、OCI-Lyl与OCI-Ly10 (P=0.279)、OCI-Ly8与OCI-Ly10 (P=0.397),两两相比均无统计学差异。(3)L428细胞中RANTES的分泌高于OCI-Ly1)、OCI-Ly8或OCI-Ly10细胞,两者相比较均有统计学差异(P=0.000); OCI-Ly1与OCI-Ly8(P=0.885)、OCI-Ly1与OCI-Ly10(P=0.979)、OCI-Ly8与OCI-Ly10(P=0.906),两两相比较均无统计学差异。(4)与L428共培养时趋化的CD4+T细胞(340.556±15.852),高于与OCI-Ly1共培养能趋化的CD4+T细胞(79.333±10.782),两者相比有统计学意义(P=0.000)；同时若向L428培养基中加RANTES,可导致趋化的CD4+T细胞增加(571.111±14.049),若向L428培养基中加anti-RANTES抗体,可导致趋化的CD4+T细胞减少(149.222±16.092),两者相比有统计学意义(P=0.000)。2. RANTES与CD99、NF-κB信号通路的关系(1)在传代过程中发现与A20细胞相比较,mCD99L2-A20细胞的大细胞数量明显增多,胞浆较丰富,细胞核明显增大,出现较多双核、多核细胞；与L428细胞相比较,L428-CD99细胞中的大细胞数量明显减少,细胞更具有一致性。(2) RT-PCR及荧光定量PCR检测：mCD99L2-A20细胞的mCD99基因,为A20细胞的0.519±0.004倍,呈低水平表达,两者相比有统计学意义(P=0.000); mCD99L2-A20细胞的mRANTES mRNA,为A20细胞的15.224±0.984倍,两者相比有统计学意义(P=0.000);L428-CD99细胞的hCD99基因是L428细胞的24.503±0.681倍,两者相比有统计学意义(P=0.000); L428-CD99细胞的hu-RANTES mRNA较L428细胞减少80.932±2.062倍,两者相比有统计学意义(P=0.000)。(3)荧光共聚集检测：mCD99L2ˉA20细胞内RANTES蛋白的表达高于A20细胞,L428-CD99细胞内RANTES蛋白的表达低于L428细胞；(4) Western blotting检测：mCD99L2ˉA20细胞mCD99蛋白弱于A20细胞,p-iκBα蛋白强于A20细胞；mCD99L2ˉA20细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理对mCD99蛋白无影响,但p-iκBα蛋白表达明显下降；A20细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理对mCD99蛋白无影响,但p-iκBα蛋白表达明显增强。L428细胞hCD99蛋白弱于L428-CD99细胞；L428细胞经NF-kB信号通路抑制剂BAY处理对hCD99蛋白无影响,但p-iκBα蛋白表达明显下降；L428-CD99细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理对hCD99蛋白无影响,但p-iκBα蛋白表达明显增强。(5) mCD99L2ˉA20细胞分泌RANTES的量为432.722±10.735,高于A20细胞分泌RANTES的量39.343±1.819,两者相比具有统计学意义(P=0.000,),且mCD99L2ˉA20细胞经NF-kB信号通路抑制剂BAY处理后其分泌RANTES量为116.391±6.241,比处理前明显减少,两者相比具有统计学意义(P=0.000)；A20细胞经NF-kB信号通路激活剂LPS处理后其分泌RANTES量为246.838±7.163,比处理前明显增加,两者相比具有统计学意义(P=0.000)。L428-CD99细胞分泌RANTES的量为44.612±3.228,低于L428细胞分泌RANTES的量839.388±2.605,两者相比具有统计学意义(P=0.000)；且L428细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理后其分泌RANTES量为109.107±5.100,比处理前明显减少,两者相比具有统计学意义(P=0.000); L428-CD99细胞经NF-kB信号通路激活剂LPS处理后其分泌RANTES量为443.618±12.514,比处理前明显增加,两者相比具有统计学意义(P=0.000)。3. BALB/c小鼠1型糖尿病模型及其外周血RANTES表达(1)A组糖尿病成模率为86.67%,C组糖尿病成模率为93.33%,血糖均在3w后稳定在较高水平且无明显下降,两组糖尿病模率相比无统计学差异(P=1.000)。(2)糖尿病成模组与对照组外周血CD4+ CD25+ Treg分别为4.059%±0.384%和8.576%±0.536%,两组相比较有统计学意义(P=0.000)(3)糖尿病成模组与对照组外周血RANTES分别为124.551±3.683 pg/ml和87.222±6.707 pg/ml,两组相比较有统计学意义(P=0.000)4.糖尿病鼠类人霍奇金淋巴瘤荷瘤模型及RANTES表达(1) mCD99L2-A20细胞成瘤情况：20只1型糖尿病BALB/c小鼠,成瘤6只(成瘤率30%),成瘤于腋下或腹股沟淋巴结,成瘤时间为34.67±2.16d；20只正常BALB/c小鼠均未成瘤。(2)糖尿病BALB/c小鼠mCD99L2-A20细胞成瘤生长速度,慢于A20细胞接种正常BALB/c鼠成瘤,两者相比有统计学意义(P=0.000)。(3)病理变化：肉眼观切面灰白,质实；镜下大细胞散在分布于被膜下淋巴窦和髓窦,其周围为小淋巴细胞浸润,与cHL早期形态相似；免疫组化检测背景CD3阳性细胞数多于CD20阳性细胞数。(4) DNA-PCR检测糖尿病BALB/c小鼠瘤组织中有mCD99L2-A20干扰载体。(5)外周血CD4+ CD25+Treg细胞,成瘤糖尿病鼠为31.293%±1.573%,高于未成瘤糖尿病鼠4.493%±0.238%,两者相比有统计学意义(P=0.000)(6)外周血RANTES成瘤糖尿病鼠为257.293±5.696,高于未成瘤鼠RANTES 124.342±3.882,两者相比有统计学意义(P=0.000)。结论1.H/RS细胞高分泌RANTES有利于趋化更多的CD4+T细胞。2. mCD99L2- A20类H/RS细胞RANTES为较高表达,其RANTES的分泌受NF-kB信号通路的调控。3.类H/RS细胞糖尿病鼠荷瘤模型初步具有人早期cHL淋巴瘤的一些特征。4.类人霍奇金淋巴瘤荷瘤模型外周血RANTES含量明显增加。创新之处1.本研究从cHL的微环境入手,对比检测了cHL和DLBCL细胞和组织中RANTES表达的差异,论证了高分泌RANTES的cHL细胞对CD4+T细胞的具有更强的趋化作用,利于cHL的形成。2.证实了本课题组构建的mCD99L2-A20细胞亚系具有与H/RS细胞相似的特性,高表达RANTES;巧妙地运用1型糖尿病BALB/c小鼠免疫力受抑制和高表达RANTES的特点,首次探索经鼠尾静脉注射mCD99L2-A20细胞,获得了成瘤。3.构建的糖尿病鼠类人早期cHL模型位于淋巴结内,背景细胞以T淋巴细胞为主,高表达RANTES,为进一步调控RANTES表达构建典型的类人cHL动物模型奠定一定的理论和实验基础。