糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管病变,也是导致终末期肾病(end stage of renal disease, ESRD)的重要原因之一。虽然大量的研究证实异常的脂质代谢,氧化应激,肾素血管紧张素系统的失调,炎性反应,体内血流动力学的改变以及遗传因素均是糖尿病肾病发病的重要因素,但针对以上因素进行干预并不能有效阻滞糖尿病肾病的发生发展,因此深入探讨糖尿病肾病的发病机制,寻找新的药物靶点具有重要意义。Arrestins是具有多种功能的小分子蛋白,家族有四个成员,arrestin1 (visual arrestin)与arrestin4 (cone arrestin)特异性的分布在调节光感相关的信号转导的视觉系统组织中。其中arrestin3 (β-arrestin-1 (Arrbl))和arrestin4 (β-arrestin-2 (Arrb2))两个亚型在心脏、大腩、垂体、脾、肝脏、肾脏、胰腺等组织中广泛表达,并具有78%的氨基酸序列相同。β-arrestins基本结构是由两个反向平行的β折叠片组成,通过铰链区与氨基端短α螺旋相连。β-arrestins主要有两个功能区,N端和C端功能区,N端功能区负责识别已被激活的G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors, GPCRs), C端功能区是第二受体识别区。最初研究发现β-arrestins作为GPCRs的负性调控因子,通过介导GPCRs的脱敏、内吞、降解导致信号转导减弱或终止而发挥作用。近些年来发现β-arrestins可以作为桥梁蛋白或支架蛋白作用于细胞内多种信号分子,调节胞外信息向胞内的传递,影响机体细胞的增殖、凋亡以及免疫应答反应,与心血管、呼吸、内分泌、神经和免疫等系统疾病的发生发展有关,仍在糖尿病肾病中的作用尚无报道。足细胞(podocyte),即肾小囊脏层上皮细胞,它附着于肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)的外侧,与基底膜和毛细血管内皮一起构成了肾小球血液滤过屏障。足细胞损伤是糖尿病肾病的早期事件,足细胞的脱落或者凋亡引起肾小球滤过屏障破坏,蛋白尿的发生,最终导致ESRD。大量的研究表明多种信号通路参与糖尿病肾病中足细胞的损伤,其中足细胞自噬水平的降低在肾脏足细胞损伤中起到重要作用,但在糖尿病肾病中自噬的变化以及具体的调控机制尚不清楚。因此深入研究自噬在糖尿病肾病中的作用及调控机制具有重要的意义。研究目的1、明确β-arrestins在糖尿病肾病中表达变化及其在糖尿病肾病发生发展中的作用。2、阐明β-arrestin-1和β-arrestin-2在足细胞损伤中的作用及分子机制。3、探讨P-arrestin-1与β-arrestin-2调控足细胞自噬水平的机制。研究方法第一部分：β-arrestin-1/2在糖尿病肾病中的表达与作用1.1在糖尿病肾病肾活检样本中β-arrestin-1与β-arrestin-2表达检测获取正常、糖尿病非肾病(diabetic mellitus non-nephropathy, DM-NN)及糖尿病肾病病人肾穿刺样本,免疫组化(immunohistochemical, IHC)与实时定里RT-PCR检测样本内β-arrestin-1与β-arrestin-2蛋白和mRNA水平的变化。同时收集病人生理指标与肾脏相关指标,分析病人肾脏功能损伤与β-arrestins表达的相关性。1.2动物学研究1.2.1 STZ诱导的糖尿病小鼠肾皮质组织中β-arrestin-1与β-arrestin-2表达检测：雄性野生型(wild type, WT) C57BL/6J小鼠,年龄6-8周,随机分组,先手术切除一侧肾脏,恢复一周左右,每天腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 1 OOmg/kg的剂量连续三天诱导Ⅰ型糖尿病肾病。检测空腹血糖(>16mmol/l)、24h尿蛋白等指标确定糖尿病肾病造模是否成功。采用实时定量RT-PCR与蛋白免疫印迹(western blot, WB)检测β-arrestin-1和β-arrestin-2在野生型小鼠肾皮质中的表达情况。在野生型小鼠肾脏石蜡切片中采用原位杂交(in stu hybridization, ISH)与IHC的方法检测β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达部位与表达变化。在野生型小鼠肾脏石蜡切片中采用免疫荧光双标(immunofluorescence, IF)的方法,检测小鼠肾脏中β-arrestins与肾小球足细胞的共定位。除此之外,进一步就自噬相关蛋白的表达变化进行检测。1.2.2 II型糖尿病肾病db/db小鼠肾皮质组织中β-arrestin-1与β-arrestin-2的表达检测采用WB检测db/+组小鼠与db/db组小鼠肾皮质组织中β-arrestin-1与β-arrestin-2表达的变化。1.2.3基因敲除Arrb1/2对肾脏功能的影响雄性β-arrestin-1 (Arrb1-/-)与β-arrestin-2 (Arrb2-/-)敲基因小鼠,周龄6-8周,体重22±2g。摘单肾加腹腔注射STZ诱导Ⅰ型糖尿病肾病模型(具体操作与检测同前面野生型小鼠造模方法)。Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)试剂盒检测糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白,以及肌酐试剂盒检测尿肌酐的含量。计算得出野生型以及敲基因小鼠正常与模型对照组的尿微量白蛋白与尿肌酐的比值(urinary microalbuminuria/creatinine ratio, UACR)。采用WB检测野生型和基因敲除小鼠肾皮质组织中自噬相关蛋白的变化(LC3与ATG12-ATG5)。在石蜡切片中,过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain, PAS)检测敲基因小鼠与野生型小鼠肾脏损伤形态学的变化。采用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察野生型和基因敲除小鼠肾脏超微结构的变化。同时用Image J软件分析基底膜厚度(GBM thickness)、足细胞宽度(foot process width)以及单位长度基底膜下足细胞的个数(number of foot process/μmGBM)。1.3体外实验研究1.3.1 β-arrestin-1与β-arrestin-2在足细胞中的表达变化体外培养肾小球足细胞,体外模拟糖尿病肾病病理状态,WB检测肾小球足细胞在高糖(high glucose, HG)、糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGE)和转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)等刺激下β-arrestin-1与β-arrestin-2表达的变化。第二部分：β-arrestin-1/2对足细胞自噬水平的调控及机制研究2.1 β-arrestins表达的干预及其对足细胞自噬水平的影响分别转染shRNA-β-arrestin-1和shRNA-β-arrestin-2质粒,基因沉默足细胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达。WB检测Arrb1和Arrb2沉默后HG刺激下足细胞自噬相关蛋白表达的变化；TEM观察Arrbl和Arrb2沉默对足细胞自噬的影响；采用腺病毒作为载体的GFP-LC3-RFP质粒转染足细胞,检测Arrb1和Arrb2基因沉默对足细胞自噬流的影响。2.2 Arrb1与Arrb2基因沉默介导的自噬激活对足细胞功能的影响流式细胞仪检测自噬抑制剂3-Methyladenine (3-MA)与沉默自噬相关基因ATG3对足细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测Arrb1和Arrb2基因的沉默与过表达以及雷帕霉素(Rapamycin)、氯喹(Chloroquine)和巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)的干预对足细胞凋亡的影响。2.3 βp-arrestins对P13K复合物的影响检测免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)检测β-arrestin-1和P-arrestin-2与beclin-1和VPS34的相互作用,Co-IP检测β-arrestin-1和β-arrestin-2沉默对beclin-1和VPS34结合的影响。2.4 β-arrestins对ATG12-ATG5结合影响检测Co-IP检测β-arrestin-1和β-arrestin-2与ATG7的相互作用。WB检测Arrbl和Arrb2沉默后ATG12-ATG5复合物的变化。研究结果第一部分：β-arrestin-1/2在糖尿病肾病中的表达与作用1.1糖尿病肾病患者肾活检标本中β-arreestin-1/2的表达变化IHC发现在糖尿病肾病患者肾活检标本中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达量都明显上调；糖尿病肾病肾活检样本中P-arrestin-1和β-arrestin-2的nRNA水平较正常人群显著升高；相关性分析发现β-arrestin-1 (Spearman r=-0.7471, P<0.01)和β-arrestin-2(Spearman r=-0.7845,P<0.01)的mRNA水平与estimated glomerular filtration rate (eGFR)成负相关。表明P-arrestin-1和β-arrestin-2的过表达与糖尿病肾病的发生发展有关。1.2动物学研究1.2.1 STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中β-arrestin-1/2表达的变化单肾切除加腹腔注射STZ后饲养12周可成功建立DN小鼠模型。ISH与IHC实验均证实在DN小鼠肾皮质中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达在肾小球与肾小管中均有明显升高。实时定量RT-PCR与WB检测结果显示DN小鼠肾皮质中Arrb1和Arrb2的mRNA与蛋白水平均升高。1.2.2 Ⅱ型糖尿病肾病db/db小鼠肾皮质组织中β-arrestin-1/2表达的变化WB检测发现与db/+正常对照小鼠相比较,db/db小鼠肾皮质组织中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达明显升高。1.2.3基因敲除Arrb1/2能够减轻糖尿病肾病小鼠肾脏损伤单侧肾摘除外加腹腔注射STZ诱导的DN小鼠模型中,Arrb1-/-和Arrb2-/-基因敲除组肾脏损伤明显减轻,UACR明显降低,PAS染色显示肾小球系膜增生以及糖原沉积明显减少,TEM观察显示肾脏超微结构的改善：基底膜厚度明显降低,足细胞的宽度也明显降低,足细胞足突脱落以及足突融合的明显减少,足细胞个数明显增加。1.2.4基因敲除Arrb1/2能够增加体内自噬相关蛋白表达WB结果显示,糖尿病肾病小鼠肾脏皮质组织中LC3II/LC3I的比值以及ATG12-ATG5复合物明显降低,Arrb1-/-和Arrb2-/-基因敲除后能明显增加糖尿病肾病小鼠肾皮质组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5复合物。1.3体外实验研究1.3.1高糖条件下足细胞内β-arrestin-1/2的表达变化用synaptopodin抗体特异性标记足细胞,检测糖尿病肾病小鼠足细胞中β-arrestin-1和P-arrestin-2表达变化。结果显示足细胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表达明显升高,而且在DN小鼠肾小管内P-arrestin-2的升高较p-arrestin-1更明显。WB检测足细胞在模拟体内DN环境的损伤因子HG, AGE, TGF-β1的刺激下β-arrestin-1和P-arrestin-2蛋白表达明显升高并且具有浓度依赖性。第二部分：β-arrestin-1/2对足细胞自噬水平的调控及机制研究2.1 Arrb1/2基因沉默促进高糖环境下足细胞自噬的恢复分别转染shRN A-β-arrestin-1和shRNA-β-arrestin-2质粒,WB检测转染沉默效率,结果显示β-arrestin-1和β-arrestin-2蛋白表达有50%左右的降低。TEM观察显示Arrbl和Arrb2基因沉默能明显增加足细胞内的自噬小体的数目。WB检测发现Arrbl和Arrb2沉默后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高。转染足细胞腺病毒GFP-LC3-RFP质粒,标记足细胞内自噬小体以及自噬溶酶体的变化,应用激光共聚焦观察发现Arrb1和Arrb2沉默后不仅能增加自噬小体的数目(黄色颗粒)还能增加自噬溶酶体(红色颗粒)的数目。2.2 Arrbl/2基因沉默介导的自噬的激活抑制足细胞凋亡我们采用两种方法检测自噬抑制对足细胞的影响,加入自噬抑制剂3-MA后足细胞的凋亡明显升高,基因沉默自噬相关基因ATG3后,足细胞的凋亡较阴性对照组(Scramble)也有明显的升高,提示自噬对足细胞有一定的保护作用。实验结果显示HG刺激下,足细胞的凋亡有所增加,Arrb1和Arrb2的基因沉默以及自噬激活剂Rapamycin的干预都能明显减少足细胞的凋亡。转染β-arrestin-1和β-arrestin-2过表达质粒组相对于Scramble组足细胞的凋亡有明显的升高,而且足细胞的凋亡可以被自噬激活剂Rapamycin的干预所抑制,提示Arrbl和Arrb2的基因沉默介导的自噬的激活可以降低足细胞的凋亡。2.3 β-arrestin-1/2对Ⅲ型P13K复合物的影响Co-IP检测发现在足细胞中β-arrestin-1和P-arrestin-2分别与beclin-1和VPS34有结合,而且在HG刺激下它们的结合还有所升高,但是Arrb1和Arrb2基因沉默后并不影响beclin-1与VPS34的结合。2.4 β-arrestin-1/2负调控ATG12-ATG5结合抑制足细胞自噬Co-IP检测显示,P-arrestin-1和β-arrestin-2分别与ATG7有结合,而且在HG刺激下,它们的结合有所升高。转染过表达β-arrestin-1和β-arrestin-2后,足细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5复合物显著降低,转染沉默Arrbl和Arrb2后,足细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5复合物明显升高。提示β-arrestin-1和β-arrestin-2与ATG7的结合,减少了游离的ATG7,降低影响ATG7催化下游ATG12-ATG5复合物的形成以及LC3的转化,抑制足细胞的自噬,加剧足细胞的损伤与凋亡。结论及创新性1. β-arrestin-1/2在糖尿病肾病足细胞损伤中起到了重要作用。高糖刺激下,β-arrestin-1/2在足细胞内表达升高,降低足细胞内的自噬,增加足细胞凋亡,致使足细胞脱落,肾小球的过滤屏障被破坏,产生蛋白尿引起肾损伤。基因敲除或干扰沉默Arrbl和Arrb2后能增加足细胞的自噬,并改善糖尿病肾病的肾损伤。2. β-arrestin-1/2降低足细胞自噬水平的机制是：β-arrestin-1/2与自噬相关蛋白ATG7结合,阻碍ATG7的催化作用,影响了下游ATG12-ATG5的结合,导致自噬过程受到抑制。3.本实课题首次明确了β-arrestin-1/2在糖尿病肾病中的作用,并且β-arrestin-1和β-arrestin-2通过降低ATG12-ATG5的结合,抑制足细胞的自噬进而增加足细胞的凋亡导致肾脏损伤。为寻找糖尿病肾病防治的新的靶点提供实验基础。