论文部分内容阅读
目的:建立大鼠在体心肌缺血预适应(IPC)模型,提取IPC模型大鼠循环血中的微囊泡(MVs),采用流式细胞术对IPC-MVs进行鉴定,Microarray 分析IPC-MVs中差异表达的microRNA(miRNA),并预测其靶基因,以探讨IPC-MVs对大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用及可能参与调控的miRNA。方法:1.大鼠心肌IPC模型的建立健康雄性Wistar 大鼠随机分为假手术(Sham),I/R和IPC三组,n=10。大鼠麻醉后取仰卧位固定,连接心电图实时监测大鼠心电图(ECG),颈动脉插管监测平均动脉压(MAP),而后行开胸处理。①Sham组组:于冠状动脉左前降支(LAD)下穿线后旷置195 min;②I/R组:于LAD穿线后旷置45分钟,行长时间I/R处理,即缺血30分钟/再灌注120分钟;③IPC组:于LAD下穿线后旷置15分钟,先行短暂I/R预处理,即缺血5分钟/再灌注5分钟,重复三个循环,再行缺血30分钟/再灌注120分钟处理。分别记录三组出现的室性心律失常情况,台盼蓝/TTC双染法检测心肌梗死面积。2.循环血中MVs的提取及鉴定取健康雄性Wistar大鼠,并将其随机分为Sham-MVs和IPC-MVs两组,n=5。大鼠麻醉后取仰卧位固定,连接心电图实时监测大鼠ECG,而后行开胸处理。①Sham-MVs组:于LAD下穿线后旷置45 min,经腹主动脉取血;②IPC-MVs组:于LAD下穿线后旷置15分钟,行缺血5分钟/再灌注5分钟三次重复的处理,而后自腹主动脉取血。两组血样经多步离心得到无血小板血清,随后低温超速离心分别得到Sham-MVs和IPC-MVs。将MVs用生理盐水重悬,液氮速冻后置-80℃保存备用。流式细胞术检测MVs 的数量和来源,BCA法对MVs内蛋白质进行定量。3.大鼠心肌I/R模型的建立取健康的雄性Wistar大鼠,并将其随机分为Sham和I/R两组,n=5。大鼠麻醉后取仰卧位固定,连接心电图买时监测大鼠ECG,颈动脉插管监测MAP,而后行开胸处理。①Sham组:于LAD穿线后旷置145 min;②I/R组:于LAD穿线后旷置15分钟,行长时间的I/R处理,即缺血30分钟/再灌注120分钟。记录I/R期间出现室性心律失常的情况,台盼蓝/TTC双染法检测心肌梗死面积。4.IPC-MVs处理I/R损伤大鼠健康雄性Wistar大鼠随机分为Sham、I/R、Sham-MVs处理(Sham-MVs+I/R)和IPC-MVs处理(IPC-MVs+I/R)组,共四组,n=5。大鼠麻醉后取仰卧位固定,连接心电图实时监测大鼠ECG,而后行开胸处理。①Sham组:LAD穿线旷置40 min后,股静脉注射生理盐水(NS);②I/R组:LAD下穿线后旷置15 min,行I/R处理,于缺血25 min股静脉注射NS;③Sham-MVs+I/R组:LAD下穿线后旷置15 min,行I/R处理,于缺血25 min股静脉注射Sham-MVs;④IPC-MVs+I/R组:LAD下穿线后旷置15 min,行I/R处理,于缺血25 min股静脉注射IPC-MVs。两MVs处理组,注射MVs的量均为7mg/kg,Sham和I/R组注射与MVs组等量的NS,MVs或NS于1 min内匀速注射完成。实时监测大鼠MAP,记录实验期间大鼠室性心律失常发生情况,测定4组大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)活力,利用台盼蓝/TTC双染法检测心肌梗死面积。5.IPC-MVs芯片分析及靶基因预测提取Sham-MVs和IPC-MVs中总RNA,利用Qubit检测RNA质量,而后进行芯片杂交分析两组间miRNA表达谱的差异,采用miRNAorg,Targetscan和Pita数据库对靶基因进行预测。GO和KEGG数据库用于分析差异表达miRNA调节的靶基因功能。CytoScape建立miRNA与mRNA网络调控图,识别可能的核心靶基因。6.qRT-PCR验证芯片结果实时定量PCR(qRT-PCR)验证IPC-MVs及Sham-MVs中差异表达的miRNA是否与芯片结果一致。结果:1.成功建立大鼠心肌IPC模型再灌注120min时,与I/R组相比,IPC组MAP显著回升(59.92±13.72 mmHg vs 53.29±11.62 mmHg,P<0.05),HR显著恢复(320±14 beats/min vs 305±29beats/min,P<0.05)。IPC组缺血期室性早搏(VPC)和室速(VT)首次出现时间明显推迟(14.48±4.86 min vs 6.54±1.19 min,P<0.001;17.41±6.63 min vs 7.33±1.83 min,P<0.001),VPC 个数明显减少(23±15 vs 237±78,P<0.001),VT持续时间明显缩短(12.89±16.94 s vs 59.33±41.27 s,P<0.01),心肌梗死面积明显缩小(20.10 ± 7.8%vs 42.98±4.7%,P<0.001)。大鼠心肌IPC模型建立成功。2.MVs的提取及鉴定通过低温超速离心成功提取到Sham-MVs和IPC-MYs。BCA法对IPC-MVs和Sham-MVs进行蛋白定量得到其蛋白质浓度分别为4.19±0.07μg/μL和4.13±0.03 μg/μL。利用流式细胞仪对其进行计数及表型鉴定,将1 μm以下的微球定义为MVs,将对应荧光抗体显现阳性的微粒定义为不同细胞来源的MVs。与Sham 组相比,IPC-MVs 中血小板来源(IPC-PMVs,2415±225 events/μL vs 1835 ±119 events/μL,P<0.001)和红细胞来源(IPC-RMVs,1609±357 events/μL vs 1051±183 events/μL,P<0.05)的数量均显著增加,IPC-MVs 总数(4225±763 events/μL vs 3691 ± 654 events/μL)、内皮细胞来源(IPC-EMVs,473±79 events/μL vs 415±41 events/μL)和白细胞来源(IPC-LMVs,115±29 events/μL vs 95±17 events/μL)的数量虽有所增加,但差异无显著性。3.成功建立大鼠心肌I/R损伤模型与Sham组相比,I/R组大鼠HR于I/R期间进行性下降,至再灌注120 min,HR 较缺血前显著降低(315±26 beats/minvs389±22 beats/min,P<0.001)。缺血立即 MAP 显著下降(58.91±12.23 mmHg vs 83.34±12.30 mmHg,P<0.001),ST-段显著抬高(0.176±0.044 mV vs 0.045±0.016 mV,P<0.01),至缺血 30 min,ST-段抬高至峰值(0.595±0.120 mV vs 0.042±0.038 mV,P<0.001)。缺血 VPC 和VT出现的较早,,VPC首次出现时间在7.44±0.94 min,个数为193±75;VT首次出现时间为7.54±1.06 min,持续时间58.75±34.85 s。心肌组织梗死区/危险区(IS/AAR)为46.00±6.4%。大鼠心肌I/R损伤模型建立成功。4.IPC-MVs减轻大鼠心肌I/R损伤与Sham组相比,I/R组大鼠HR于I/R期间进行性下降,至再灌注120 min,HR 较缺血前显著降低(263±2 beats/minvs3588± beats/min,P<0.01)。缺血立即 MAP 显著下降(45.50±3.84 mmHg vs 92.27±11.61 mmHg,P<0.001),ST-段显著抬高(0.212±0.095 mVs vs 0.023±0.004 mVs,P<0.01),IS/AAR 为 44.79 ±9.2%。与I/R组相比,至再灌注120 min IPC-MVs组MAP显著回升(74.14±8.20 mmHg vs 61.57±8.93 mmHg,P<0.05),HR显著恢复(302±23 beat/min vs 263±28 beat/min,P<0.05),LDH 活力显著下降(11.791±2.310 U/mL vs 15.832±2.102 U/mL,P<0.01)。心肌梗死面积较 I/R 组显著减小(24.68±7.5%vs 44.79±9.2%,P<0.01)。而Sham-MVs组HR、MAP、ST段、LDH和心肌梗死面积与I/R组均无显著性变化。5.IPC-MVs差异性表达miRNA及靶基因预测根据标准数据分析结果显示,与Sham-MVs组相比,IPC-MVs组中显著变化的 miRNA 共有 5 个(P<0.01,FER<0.05)。其中 miR-1-3p,miR-378b,miR-133a-3p和miR-133b-3p上调,miR-702-3p下调。GO分析结果显示,差异表达的5个miRNA在生物过程中最有可能参与的是负性调节细胞凋亡,调节体内钙离子浓度,调节血压以及参与在缺血缺氧环境下引起的缺氧应答等过程。差异表达的miRNA靶基因显著富集在多种心血管疾病相关通路,如醛固酮调节的钠离子重吸收,白细胞跨内皮迁移,抗利尿激素调节的水重吸收,鞘脂类信号通路,磷脂酰肌醇信号系统和HIF-1信号通路等。miRNA-mRNA网络图显示差异表达的 miRNA 核心靶基因是 Pcdha4、Acvrl1、Ndrgl、Ddi2、Syt1、Vamp2、Tagln2、Ifit2、Slc6a7、Bc1212、Hsd17b11、Sv2a、Sulfi 和 Hivep2。6.qRT-PCR 结果qRT-PCR 结果结果显示,与 Sham-MVs 相比,miR-1-3p,miR-133a-3p,miR-133b-3p显著上调,表达情况与芯片结果一致。但miR-378b,miR-702-3p表达与芯片结果趋势相反,表现为miR-378b显著下调,miR-702-3p显著上调。结论:1.成功建立大鼠在体IPC模型。2.成功提取IPC-MVs,并且来源于血小板和红细胞的MVs显著增加。3.股静脉注射7 mg/kg的IPC-MVs能有效减轻大鼠心肌的I/R损伤。4.与 Sham-MVs 相比,IPC-MVs携带的 miR-1-3p,miR-133a-3p,miR-133b-3p和miR-702-3p显著上调,miR-378b显著下调。5.差异表达的miRNA调控的靶基因可能参与调节细胞内钙离子浓度、抗细胞凋亡,通过调节HIF-1等通路发挥抗心肌I/R损伤的作用。