研究背景血管生成是新生血管形成的基础,近年来,有大量的研究表明,血管生成在肿瘤的发生和发展中起到重要作用。因此,抗肿瘤血管生成研究是抗肿瘤治疗领域中极有前景的一个重要方向。但是近年来,陆续发现多个美国食品药品监督管理局(FDA)批准的血管生成抑制剂,特别是针对血管内皮细胞生长因子的单抗类药物,在临床前或临床水平上表现出严重毒副作用。因此,寻找新靶点或新药物分子对于抗肿瘤血管生成新策略的开发具有重要的意义。既往研究发现速激肽受体家族的重要成员之一,神经激肽-3受体(NK3R),在机体内多种生理过程中起到重要作用,但对其在血管生成中的作用和机制仍然不清楚。已有研究发现,NK3R的高亲和配体,内源性神经激肽B(NKB)可抑制血管生成,这表明靶向抑制NK3R通路可有效阻断新生血管生成。基于以上研究,本论文基于NK3R激动剂[MePhe7]NKB,通过引入肿瘤靶向序列NGR和CNGRC,分别构建了两种类似物NK3R-A1与NK3R-A2。通过一系列体内外实验探索NK3R激动剂及其类似物的抗血管生成作用和抗肿瘤效应,通过联合应用NK3R选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]研究NK3R激动剂及其类似物的作用机制。研究目的本研究的主要目的是对本论文设计的两种基于NK3R激动剂[MePhe7]NKB结构进行改造的NK3R激动剂类似物NK3R-A1和NK3R-A2在体内和体外分别进行抗血管生成作用及其机制的研究。研究方法基于本实验室前期工作基础,通过大量文献查阅,本论文从NK3R激动剂[MePhe7]NKB出发,通过引入两类肿瘤靶向序列,构建了结构改造的NK3R激动剂类似物NK3R-A1和NK3R-A2。通过Fmoc固相合成策略合成了NK3R激动剂及其类似物以及NK3R拮抗剂[Gly6]NKB[3-10],以反相高效液相色谱法进行纯化,经质谱确认结构正确。然后通过明胶海绵-鸡胚尿囊膜(gelatin sponge-CAM)实验对上述三种NK3R激动剂及其类似物进行抗血管生成作用的研究,并运用拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]进行相应的竞争性实验,以验证它们的作用机制;其次通过体外的MTT细胞增殖实验以及两种经典的迁移实验,对这三种NK3R激动剂及其类似物进行体外的抗血管生成研究,同时利用[Gly6]NKB[3-10]进行相应的竞争性实验探讨其作用机制;另外,本研究还进行了体内小鼠移植瘤实验模型和免疫组织化学(IHC)染色实验对经过药物处理的肿瘤组织进行结果分析。并最终对待测多肽类药物的抑瘤效果和抗肿瘤血管生成作用进行评估。研究结果以Fmoc固相多肽合成方法合成了NK3R激动剂及其类似物[MePhe7]NKB(Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)、NK3R-A1(Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)、NK3R-A2(Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)以及NK3R选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10](His-Asp-Phe-Gly-Val-Gly-Leu-Met-NH2),以反相高效液相色谱仪纯化,质谱鉴定证明分子量正确。进一步的gelatin sponge-CAM实验结果表明,上述三种NK3R激动剂及其类似物都体现出了抗血管生成作用。用NK3R选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]预处理后,三种多肽的抗血管生成作用均被抑制。随后进入体外研究,MTT细胞活性实验结果显示,三种被检测多肽在24小时内对HUVECs的增殖没有明显的影响,但药物作用大于24小时后,出现了一定的细胞杀伤作用,因此在后续的细胞迁移实验中药物处理时间限时在24小时之内。在细胞划痕实验中,50μM的[MePhe7]NKB、25μM的NK3R-A1和NK3R-A2在药物作用24小时时体现了最好的抑制HUVECs迁移的效果。抑制率分别达到了20.0%、73.2%以及53.7%;Transwell细胞迁移实验中也得到了相似的实验结果,阴性对照组的迁移细胞数目分别是5μM的[MePhe7]NKB、NK3R-A1与NK3R-A2的2.3倍、5.0倍和7.0倍,三种多肽都体现出了在体外很好的抑制HUVECs迁移的效果,证明了它们在体外的抗血管生成作用。值得注意的是,NK3R-A1与NK3R-A2在细胞迁移实验中相较于[MePhe7]NKB,具有更好的抗血管生成作用。联合应用拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]对HUVECs进行预处理后,三种多肽的抗血管生成作用被明显抑制,证明其抗血管生成作用是通过NK3R通路介导的。细胞划痕竞争性结合实验中,NK3R-A1与NK3R-A2拮抗组的“愈合程度”分别达到了96.3%和97.6%,[MePhe7]NKB拮抗组的“愈合程度”几乎达到和阴性对照组相同的水平,说明三种检测多肽的抗血管生成作用几乎被完全拮抗;Transwell细胞迁移竞争性结合实验数据显示,拮抗组的迁移细胞数目分别是[MePhe7]NKB、NK3R-A1与NK3R-A2单独处理组的3.9倍、2.8倍和3.3倍,依旧在一定程度上拮抗了NK3R激动剂及其类似物的抗血管生成作用。而体内实验结果显示,和生理盐水组相比,经过三种NK3R激动剂及其类似物高低剂量组处理后,瘤组织体积在给药期间显著减小,较阴性对照组瘤体积减小50%左右。第15天,小鼠脱颈处死,取出瘤组织进行称重,发现所有的药物处理组的瘤重均明显小于生理盐水组,其中以[MePhe7]NKB的高剂量组和NK3R-A1的低剂量组表现出了更好的抑制效果,抑瘤率均达到了~60%。而IHC染色的结果也显示出,药物处理组的微血管密度(MVD)相比于阴性对照组有着明显的减少。值得注意的是,NK3R-A1与NK3R-A2药物处理组的MVD值相较于[MePhe7]NKB有所减少,说明了前两者具有一定的抗肿瘤血管生成作用。研究结论综上所述,本论文通过对NK3R激动剂及其类似物[MePhe7]NKB、NK3R-A1和NK3R-A2的抗血管生成作用及其机制的研究,为基于抗新生血管生成策略的抗肿瘤方法学的研究提供了一种全新的药物靶点NK3R,并且发现了一种具有潜力的抗血管生成药物的模板分子NK3R-A1。