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猪伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PrV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及急性脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。伪狂犬病病毒感染猪会引起种猪的繁殖障碍,妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎等,15日龄内的仔猪死亡率达100%。伪狂犬病给全球养猪业造成了巨大的经济损失,为当前危害养猪业的重大传染病之一。疫苗是预防伪狂犬病发生和传播的主要有效措施。然而,目前临床上使用的猪伪狂犬病疫苗免疫保护率欠佳。添加佐剂是当前强化疫苗免疫效果不可或缺的手段。 AJS(Albizziajulibrissin saponin)系从中药传统合欢皮中筛选得到的佐剂活性皂苷有效部位,对卵清蛋白(OVA)、禽流感鸡痘病毒载体活疫苗和禽流感-新城疫重组二联活疫苗等均具有显著的佐剂作用,且溶血性小,安全性高,是一种理想的疫苗候选佐剂。同时,前期实验发现AJS可显著降低猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗对小鼠的毒性。本文评价了AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂活性,并研究了AJS降低猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗对小鼠毒性的作用,为基于AJS佐剂的猪伪狂犬病疫苗研制与开发提供依据。 1.AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂作用采用ICR小鼠,在摸索猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫剂量的基础上,以铝胶(Alum)和Quil A为佐剂对照,猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合不同剂量的AJS(25、50、100μg)皮下注射免疫小鼠二次,间隔2周,加强免疫后14天,取血,分离制备血清。采用IDEXX猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒检测了免疫小鼠血清中猪伪狂犬病病毒gB抗体(PRV gB Ab)水平,以及间接ELISA方法分析猪伪狂犬病病毒gB特异性IgG总抗体及其亚类IgG1和IgG2b的水平,评价AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂作用。结果表明:AJS可显著提高猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠血清中PRV gB抗体水平,以及猪伪狂犬病病毒gB特异性IgG、IgG1、IgG2b抗体水平。说明AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗有显著的佐剂作用。这些结果为AJS作为猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂进行临床实验和推广应用奠定了基础。 2.AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的解毒作用采用AJS处理猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗、猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织感染Vero细胞,通过观察细胞病变(CPE),研究了AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗引起小鼠毒性的影响。采用RT-PCR法检测AJS处理猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗感染Vero细胞、猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织感染Vero细胞,以及猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织中猪伪狂犬病病毒基因组DNA及毒力基因的表达变化。猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠体内病毒定位分析结果显示:仅脑组织感染的Vero细胞发生典型的细胞病变,说明该病毒仅定位于免疫小鼠的脑组织。体内和离体实验结果表明,仅猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独免疫小鼠脑组织及其感染的Vero细胞检测到猪伪狂犬病病毒基因组DNA及毒力基因的表达。体外结果表明:在AJS对PrV的杀灭浓度范围内,AJS对猪伪狂犬病病毒感染Vero细胞gB、gD、gG等蛋白的表达无显著影响,但能显著降低毒力基因TK、pK、gI及gC的表达水平,且呈剂量依赖性。这些结果说明:AJS可通过下调猪伪狂犬病病毒毒力基因的mRNA表达,降低猪伪狂犬病病毒的毒力,从而发挥解毒作用。研究为AJS作为抗病毒药物开发及为基于AJS佐剂的猪伪狂犬病疫苗的研制与开发提供了依据。