人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是种生长较为缓慢的β型疱疹病毒,病毒基因组是双链DNA。HCMV感染健康人群一般表现是无症状,但免疫缺陷人群,它的感染会导致严重的并发症。HCMV也是一种导致新生儿先天性疾病的危险性病原。由于HCMV病毒基因组较大以及病毒本身严格的种属特异性,这使得探究HCMV致病机制变得非常困难,而且目前为止还未有许可上市的相关疫苗。本课题从病毒宿主之间的关系以及病毒基因功能解析两个方面进行探究。一:探究DDX21与HCMV病毒复制之间的关系。DDX21是一种RNA解旋酶,它能够调控RNA代谢以及一些RNA病毒的生长。我们主要探究DDX21与HCMV病毒生长之间的关系。首先,我们发现DDX21的蛋白质与mRNA水平在未感染细胞中会逐渐减少,而HCMV感染能够抑制它们的降低。病毒生长分析及RT-qPCR结果显示DDX21敲低能够显著抑制HCMV病毒的生长和病毒晚期基因的转录及表达。文献报道DDX21的敲除能够导致R-loops积累,它的生成会抑制RNA聚合酶II的延伸以及阻碍相关基因的转录。我们通过DNA-RNA免疫共沉淀实验发现DDX21敲低导致R-loops在病毒晚期基因上积累,通过RNaseH过表达处理后,晚期基因转录及病毒生长部分回复。综上所述,这些结果表明,DDX21敲低能够导致R-loops聚集在HCMV病毒晚期基因上,抑制病毒晚期基因的转录,从而抑制病毒的复制。二:探究HCMV病毒基因UL24和UL43对HCMV病毒复制的调控作用。人巨细胞病毒US22家族有12个成员,它们能够编码病毒间层蛋白(Tegument protein),这是形成完整病毒颗粒的重要成分。UL24和UL43是该家族的两个成员,它们编码的病毒蛋白pUL24和pUL43具有相互作用。通过质谱分析找到分别与pUL24、pUL43相互作用的蛋白Dicer和TRBP。我们通过免疫共沉淀实验证明pUL24、pUL43均能与Dicer和TRBP相互作用,且这种相互作用在细胞内源也存在。由于Dicer和TRBP调控miRNAs的生成,因此我们接下来检测UL24和UL43敲除是否影响病毒miRNAs的生成。通过RNA-seq我们发现在这两个基因敲除后,miR-UL59的表达受到下调,并且除了实验病毒株,我们发现临床病毒株敲除这两个基因后,miR-UL59的表达也受到下调,这些结果表明UL24和UL43的敲除能够导致病毒miR-UL59的表达下调。文献报道miR-UL59的靶基因是ULBP1,ULBP1是NKG2D的配体之一,而NKG2D是在免疫效应细胞上表达的一种活化性受体,能够识别不同的MHC I相关配体,包括MIC和ULBP蛋白。感染或应激反应都能够诱导NKG2D配体的表达,导致效应细胞的激活,最终杀死配体相关靶细胞。因此我们推测UL24和UL43是否通过调控miR-UL59影响ULBP1的表达,阻碍NK细胞对感染细胞的识别,从而帮助病毒免疫逃逸。进一步实验结果显示在这两个基因敲除后miR-UL59表达下调,ULBP1的mRNA水平上调。接下来我们将进一步检测UL24和UL43双缺失病毒感染对NK细胞介导的细胞毒性是否有影响。