单倍剂量不足（Haploinsufficiency）是指基因中一个等位基因突变或缺失,另一个等位基因正常表达,但该基因所翻译后的蛋白表达量只有正常蛋白表达水平的一半,不足以维持该基因正常的生理功能,进而导致人类多种疾病发生的基因型。其导致的疾病包括癌症、神经系统疾病、发育障碍、免疫疾病、代谢紊乱等。NF1抑癌基因突变可形成单倍剂量不足基因型,进而导致I型神经纤维瘤病,严重威胁患者生命安全。目前,临床上针对该类疾病的治疗以手术和药物为主,没有系统的疗法。近年来,基因治疗的出现给这类疾病的治愈带来希望。本课题组利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到单倍剂量不足U251细胞模型,通过CRISPR/d Cas9（CRISPRa）系统靶向NF1基因启动子,从内源性上调NF1基因的表达,表明了在单倍剂量不足U251细胞模型中恢复或提高NF1基因的表达可抑制细胞的增殖、生长和侵袭能力。实验方法:（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建NF1单倍剂量不足U251细胞模型。（2）以NF1基因启动子为靶点,设计sg RNA,构建CRISPRa体外双载体上调系统。（3）利用RT-q PCR法检测细胞中NF1 m RNA的表达量,验证CRISPRa体外上调系统是否发挥作用。（4）利用Western Blot法检测细胞中NF1蛋白的表达量,验证CRISPRa体外上调系统是否发挥作用。（5）利用CCK-8,平板克隆法,检测单倍剂量不足U251细胞模型中NF1基因的过表达对细胞增殖,克隆能力的影响。（6）利用Transwell法,检测单倍剂量不足U251细胞模型中NF1基因的过表达对细胞侵袭能力的影响。（7）以NF1启动子为靶点,按照sg RNA的设计规则,重新设计sg RNA,构建CRISPRa体内单载体上调系统。实验结果:（1）成功构建单倍剂量不足U251细胞模型（2）成功构建CRISPRa体外双载体上调系统。（3）在单倍剂量不足U251细胞中过表达NF1基因能够抑制细胞的增殖、生长、侵袭能力,显示出抗肿瘤细胞活性。（4）成功构建CRISPRa体内单载体上调系统。结论:内源性上调NF1基因的表达能够抑制单倍剂量不足U251细胞模型的生长,增殖侵袭能力,显示出肿瘤抑制效果。