天然橡胶是重要的工业原料和战略物资,属资源约束性产业,其主要来源于巴西橡胶树(简称橡胶树)。磷是橡胶树生长发育所需的重要元素,缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,橡胶园土壤有效磷普遍缺乏。因此,研究橡胶树磷营养的生理学及分子生物学机制,挖掘橡胶树高效利用磷营养的关键基因资源,对提高橡胶树磷养分的利用效率和胶乳产量具有非常重要的意义。本研究通过对橡胶树进行不同水平和不同时间的低磷胁迫处理,比较了橡胶树对低磷胁迫的形态和生理响应变化；并首次成功构建了橡胶树缺磷胁迫的抑制差减杂交文库,通过对文库中部分ESTs进行序列测定和功能分析,初步探索了橡胶树缺磷胁迫的基因表达情况。主要的研究结果如下：1.低磷胁迫对橡胶树形态特征的影响缺磷条件下,橡胶树株高、整株干重、叶干重均显著低于正常供磷,而根干重、主根长、茎粗均与正常供磷无显著差异。叶干物质分配率随着磷水平下降逐渐降低,茎干物质分配率变化趋势不明显,根干物质分配率则随着磷水平下降呈上升趋势。2.低磷胁迫对橡胶树氮、磷、钾营养特性的影响缺磷条件下,橡胶树整株、叶、茎和根吸氮量显著下降,各器官的氮素含量也显著下降,但橡胶树的氮利用效率明显提高,表明磷和氮有很好的协同效果。缺磷条件下,橡胶树整株、叶、茎和根吸钾量显著下降,但叶钾含量和根钾含量变化趋势不明显,低磷对橡胶树钾效率无显著影响。橡胶树幼苗的整株、根、茎、叶的磷积累量、磷含量、可溶性磷含量均随着磷水平的降低而明显降低。其中,低磷胁迫下根、茎中可溶性磷含量要明显高于叶可溶性磷含量；低磷胁迫下,橡胶树磷的利用效率有显著的提高。3.低磷胁迫对橡胶树生理代谢的影响低磷处理三个月后,橡胶树幼苗根、茎、叶中可溶性糖的含量均随着磷浓度的降低而降低。从处理时间来看,橡胶树叶片可溶性糖除56天外,其它各时间的缺磷处理均显著低于正常供磷；茎可溶性糖在28天时,缺磷处理显著高于正常供磷,42天后显著低于正常供磷：根可溶性糖在42天前,缺磷处理高于正常供磷,但差异不显著,42天后低磷处理显著低于正常供磷。橡胶树幼苗的叶、根可溶性蛋白随着磷浓度的降低而升高,而茎可溶性蛋白则是在42天前低磷处理略高于正常供磷,42天后,处理之间无显著差异。低磷处理56天后,橡胶树根、茎、叶中的酸性磷酸酶活性都显著高于正常供磷处理,表明在低磷胁迫下橡胶树可能通过提高酸性磷酸酶活性来提高磷的再利用效率。轻度的磷胁迫对橡胶树叶绿素含量影响不大,但随着磷胁迫程度的加深,叶绿素含量显著升高。从处理时间的变化来看,低磷处理42天前的叶绿素含量高于正常供磷,但差异不显著；低磷处理42天后的叶绿素含量显著高于正常供磷。橡胶树根硝酸还原酶活性和根活力均随着处理磷浓度的下降而下降,低磷胁迫显著低于正常供磷。4.低磷胁迫对橡胶树丙二醛含量及抗逆相关酶活性的影响橡胶树叶片、茎、根的丙二醛含量均随着磷浓度的下降而升高。并且随着处理时间的延长,低磷处理根的丙二醛含量逐渐升高,整个试验周期内,低磷处理根的丙二醛含量都显著高于正常供磷。随着磷浓度下降,叶、茎和根的超氧歧化酶(SOD)活性均显著升高。随着处理时间的延长,低磷处理的橡胶树各器官的SOD活性均逐渐升高,而正常处理均无明显变化。整个试验周期内,低磷处理都显著高于正常供磷。橡胶树叶、根中的过氧化氢酶(CAT)活性随着磷浓度的降低,逐渐升高,高度低磷胁迫下的过氧化氢酶活性均显著高于正常供磷。随着处理时间的延长,橡胶树叶、茎、根的CAT活性在低磷胁迫初期都快速升高,42天时达一个最大值,然后逐渐下降；但整个周期内,低磷胁迫的各器官CAT活性均显著高于正常供磷。随着磷浓度的降低,橡胶树叶片的过氧化物酶(POD)活性先升高,在10mg/L处理达到最大值,然后逐渐降低,在0mg/L处理达到最小值。茎的过氧化物酶活性随着磷浓度的降低,先下降,在5mg/L处理达到最小值,根的过氧化物酶活性随着磷浓度的下降而逐渐降低。低磷处理不同时间表明,在低磷胁迫初期橡胶树各器官的POD活性均高于正常供磷,但70天后显著低于正常供磷。5.缺磷胁迫下橡胶树抑制差减(SSH)文库的构建及差异表达基因分析(1)通过对差减文库克隆序列的组装和拼接,获得了橡胶树在缺磷条件下,在根中上调表达的基因(EST)94个,下调表达基因(EST)45个；在叶中上调表达的基因(EST)64个,下调表达基因(EST)166个。(2)对差异表达基因的GO分析显示：细胞组分主要有质体、核糖体、胞内成分、类囊体膜、光系统、内膜、胞质、核糖核蛋白、膜成分等；分子功能涉及离子结合、翻译因子活性、转移酶活性、连接酶活性、水解酶活性、DNA结合、RNA结合、糖基转移、叶绿素结合、双加氧酶活性；生物学过程涉及多方面,主要包括胞内应答胁迫、蛋白定位、胞内运输、离子运输、蛋白质代谢、核酸及核酸代谢、糖代谢过程、有机酸代谢、胺代谢过程、胞内生物合成过程、光合作用、大分子合成等。(3)在橡胶树根正、反差减文库中,有7个核糖体蛋白基因受磷胁迫调控,其中5个基因在根中受缺磷诱导上调表达,2个在缺磷胁迫时为下调表达。同时发现,一个AP2类转录因子、一个阳离子输出蛋白/锌转运子和一个胆汁酸/钠共转运子在缺磷处理根中为上调表达。(4)橡胶树缺磷叶正、反差减文库中,也有多个核糖体蛋白基因,其中6个在缺磷胁迫下上升表达；发现多个与光合作用相关的基因,其中分别有一个类囊体膜磷蛋白、叶绿素a/b结合蛋白和光系统I反应中心N亚基受磷胁迫上升表达,但也有3个光合作用相关基因受磷胁迫下调表达；此外,一个阳离子输出蛋白/锌转运子在缺磷处理下也上调表达。(5)利用荧光实时定量PCR分析了差减文库中四个基因,即E3泛素连接酶、水解酶、细胞色素P450类TBP蛋白和核糖体蛋白L2在缺磷处理的叶片中随缺磷处理不同时间的表达变化,结果表明这些基因均受磷胁迫调控,并且它们的整体表达模式与差减库的筛选结果一致。本文结果为深入阐述磷胁迫下橡胶树的形态、生理和分子应答奠定了良好基础,为深入了解橡胶树的磷高效营养特性、筛选橡胶树磷高效基因资源和进一步培育磷高效基因型品种奠定了前期基础。