猪的体细胞核移植(克隆)技术在畜牧业生产、人类医学、基础研究等方面都有非常重要的应用价值。但是,目前猪的体细胞克隆操作要求复杂、效率低、成本高,极大地限制了该技术的推广。为建立一种经济、有效、方便而稳定的猪体细胞克隆胚生产技术体系,以及为将来揭示猪克隆胚胎发育表观遗传修饰调控机理研究奠定基础。本研究开展了如下试验:试验一:探索了肺气对猪卵母细胞体外成熟及后续孤雌和克隆胚胎早期发育能力的影响。猪卵母细胞随机分布在三组气相环境下(lung air;5%O2;20%O2),经体外成熟后检测其细胞核成熟情况及后续孤雌和克隆胚胎发育能力。结果发现:使用肺气成熟的猪卵母细胞在核成熟率(66.5%vs.60.2%,63.2%)及后续孤雌胚胎卵裂率(94.8%vs.94.2%,85.2%)、囊胚率(39.5%vs.40.3%,32.5%)、囊胚细胞总数(37vs.38,32)与低氧(5%O2)、高氧(20%O2)差异不显著。此外,猪克隆胚胎卵裂率(88.3%vs.80.3%)、囊胚率(7.3%vs.10.7%)和囊胚细胞数(34vs.36)与高氧(20%O2)也差异不显著。结果表明:人体呼出的肺气可以安全、有效地成熟猪卵母细胞。试验二:比较了三组气相环境下(5%O2;20%O2;lung air)培养猪无透明带孤雌胚胎早期发育效率。猪卵母细胞透明带经消化去除后,施以43V,80μs,,1次的电激活后,将无透明带的卵母细胞培养在WOW(wells of well,WOW)中,观察其体外发育情况。结果发现:低氧(5%O2)和高氧(20%O2)之间的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数均差异不显著,但囊胚率和囊胚细胞数明显高于肺气组(lung air)。结果表明:使用肺气培养猪无透明带孤雌激活胚胎可能没有低氧(5%O2)和高氧(20%O2)效果好。试验三:研究了化学半限定培养基和化学限定培养基对猪孤雌和克隆胚胎早期发育的影响。猪孤雌胚胎和克隆胚胎分别随机分布在PZM-3、PZM-4、PZM-5三种培养基中培养,观察和分析其卵裂、囊胚和囊胚细胞数的情况。结果如下:对孤雌胚胎而言,三组培养基之间的卵裂率差异不显著(P>0.05),PZM-3中囊胚率显著高于PZM-4和PZM-5(78.9%vs.36.0%,52.3%)(P<0.05),并且囊胚细胞数PZM-3组明显高于PZM-5,但与PZM-4相似。就克隆胚胎而言,三组培养基之间的卵裂率和囊胚率均差异不显著(P>0.05),但囊胚细胞数PZM-3组明显高于PZM-5,并且与PZM-4组相似。上述结果表明:化学半限定培养基PZM-3和化学限定培养基PZM-4能够有效地支持猪PA和SCNT胚胎的发育。试验四:比较了不同融合激活方法对猪无透明带克隆胚胎体外发育能力的影响。猪无透明带克隆胚胎经一步法的融合同时激活方案和两步法的融合后延迟激活方案,激活后培养于WOW中观察两种激活策略的克隆胚胎早期发育情况。结果发现:两种融合激活方案之间的卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数均差异不显著(P>0.05)。但融合后延迟激活方案的囊胚率有高于融合同时激活的趋势。结果表明:融合同时激活和融合后延迟激活都能够有效地激活猪克隆胚胎,但融合后延迟激活的效果更好些。试验五:研究了不同卵胞质数量对猪无透明带克隆胚胎体外发育能力的影响。将1枚卵胞质和2枚卵胞质构建的无透明带猪重构胚,经融合后延迟激活方案处理后培养于WOW中观察和分析两组的克隆胚胎早期发育能力。结果发现:两枚卵胞质构建的克隆胚胎在卵裂率(92.1%vs.74.8%)、囊胚率(21.5%vs.9.5%)及囊胚细胞数(49vs.30)方面均显著高于对照组1枚卵胞质构建的克隆胚胎(P<0.05)。结果表明:增加去核卵细胞质的数量或体积能够提高猪克隆胚胎早期发育效率和囊胚发育质量。试验六:猪孤雌胚胎和胎儿成纤维细胞免疫荧光染色技术优化研究。结果发现:进口二抗、胚胎固定时间15min和透化时间20~30min,有透明带可以明显提高染色照片的清晰度并降低背景色。而不同代数猪胎儿成纤维细胞染色效果差异不明显。结果表明:使用进口二抗、胚胎固定时间15min和透化时间20~30min、保留透明带的免疫荧光染色效果更好。总之,本研究首次证明肺气能够经济、安全、有效地成熟猪卵母细胞并支持后续孤雌、克隆胚胎的早期发育;并且经胚胎培养基、融合激活方案、受体卵胞质体积的优化,猪克隆胚胎早期发育效率明显提高;本试验对间接免疫荧光染色技术关键环节进行了优化,不仅节省了操作时间,也改善了染色效果。