[目的]　　 胆固醇在巨噬细胞源性泡沫细胞内聚积是动脉粥样硬化(AS)形成的重要事件之一，从肝外组织清除过量胆固醇是预防和治疗AS的关键步骤。研究证实，ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)在促进胆固醇流出过程中具有重要作用。同时，环腺苷一磷酸（cAMP）可上调ABCA1表达。磷酸二酯酶7(phosphodiesterase7，PDE7)通过水解作用降低细胞组织中的cAMP浓度。而实验发现，在胆固醇累积及细胞泡沫化过程中PDE7基因表达升高。抑制PDE-7基因表达或蛋白水解酶活性可增强ABCA1表达，进而促进细胞过量胆固醇流出。为此，本实验以PDE-7A作为研究靶点，体外测定白芍水提取物(Radix Paeoniae Albaextraction，RPAE)对PDE-7A活性的影响，并在巨噬细胞源性泡沫细胞上测定其对胆固醇流出的影响及可能机制。　　 [方法]　　 1.100g粉碎的中药白芍温水(55℃)室温浸泡1h，回流提取2h，过滤。滤渣再回流提取1次，合并2次滤液，减压抽滤。所得滤液旋转蒸发浓缩至药材质量1倍，加入等体积95％乙醇，4℃静置48 h，过滤、离心，取上清再次旋转蒸发浓缩至100ml。　　 2.采用PDE-Glo Phosphodiesterase Assay Kit，体外测定RPAE对PDE-7A活性的影响，并以IBMX、BRL-50481作为对照。　　 3.CCK-8法检测RPAE细胞毒性。人THP-1细胞用160nM佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)37℃、5％CO2诱导24 h，分化为贴壁巨噬细胞。不同浓度RPAE作用于巨噬细胞24 h后，CCK-8法检测细胞存活率，并计算药物半数致死浓度值(lethal dose50％，LD50)。　　 4.THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定。160 nM PMA诱导人THP-1细胞分化为巨噬细胞后，用50μg/ml乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)孵育48 h，诱导为泡沫细胞。泡沫细胞经多聚甲醛固定、油红O染色、苏木精复染后，于相差显微镜下观察，鉴定泡沫细胞模型。进一步采用HPLC分析泡沫细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的累积。　　 5.液体闪烁计数法检测胆固醇流出率。人THP-1细胞经160 nM PMA诱导后，与3H标记胆固醇及ac-LDL共同孵育48 h后，用不同浓度RPAE(10、1.0、0.1 mg生药/ml水提取物)及10μg/ml载脂蛋白A-1（apolipoproteinA-1，apoA-1）作用24 h，分别收集培养基上清液和细胞，检测各组分的放射剂量，并计算胆固醇流出率。　　 6.不同浓度RPAE作用泡沫细胞后，试剂盒检测细胞内PDE-7A活性及cAMP相对含量变化。　　 7.不同浓度RPAE作用泡沫细胞后，Western blot检测PDE-7A、ABCA1蛋白表达变化，并通过相对光密度分析进行统计学分析。　　 [结果]　　 1.100g白芍通过水法提取，95％乙醇沉淀等处理得到100 ml水提取物溶液，即1g生药/ml白芍水提取液（RPAE）。0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冷藏保存。　　 2.RPAE对PDE-7A蛋白酶活性检测结果表明，10 mg生药/ml RPAE对PDE-7A活性具有明显抑制作用，抑制率达到86％。抑制剂IBMX与BRL-50481在222.24μg/ml、244.27μg/ml时对PDE-7A活性抑制率达到78％和88％。　　 3.CCK-8法测定表明，RPAE对THP-1巨噬细胞具有一定毒性，10、1.0、0.1 mg/ml RPAE处理组，细胞存活率分别为85.36％、95.53％和100％;LD50值为60.45 mg生药/ml RPAE， IBMX与BRL-50481的LD50值分别为840μM和720μM。　　 4.泡沫细胞经油红O染色，细胞内可见明显红色脂滴，而对照组巨噬细胞组内未见红色脂滴。HPLC分析结果显示，泡沫细胞内胆固醇酯含量为365.2mg/g细胞蛋白，占总胆固醇57.80％。与巨噬细胞组对比，泡沫细胞内胆固醇酯含量及胆固醇酯/总胆固醇比例均升高。提示泡沫细胞模型建立成功。　　 5.胆固醇流出实验结果表明，RPAE在0.1、1.0和10 mg生药/ml时，胆固醇流出率分别为8.04％、11.25％和12.32％。与apoA-1处理组对比，1 mg/ml RPAE和10 mg/ml RPAE处理组胆固醇流出率明显升高(p＜0.01)。　　 6.细胞PDE-7A活性测定表明，与apoA-1组对比，1 mg/ml RPAE和10 mg/mlRPAE处理组PDE-7A活性明显下降(p＜0.05，p＜0.01)，而cAMP相对含量升高(p＜0.05，p＜0.01)。　　 7.Western blot分析显示:RPAE处理组（0.1、1.0、10 mg生药/ml）PDE-7A蛋白水平逐渐降低，ABCA1蛋白表达依次升高。与apoA-1组相比，0.1 mg/mlRPAE组PDE-7A、ABCA1蛋白表达没有明显变化;1.0 mg/ml和10 mg/ml RPAE组PDE-7A表达降低(p＜0.05，p＜0.01)，而ABCA1蛋白表达升高(p＜0.05，p＜0.01)。　　 [结论]　　 实验表明PDE-7A与ABCA1表达及胆固醇流出呈现负调节作用。RPAE通过抑制PDE-7A蛋白表达及PDE-7A酶活性，提高细胞内cAMP相对含量，上调ABCA1蛋白表达，进而促进细胞内胆固醇流出。提示PDE-7A可作为研究及治疗AS的一个潜在靶点。