第一部分：大鼠死后视网膜细胞核DNA含量降解的图像分析【背景】死亡时间（postmortem interval，PMI，也称死后间隔时间）、尤其早期死亡时间推断，一直是法医病理学研究的重点和难点之一。准确的PMI推断可以为侦查破案工作提供线索，对于案件诉讼和审理等司法工作提供证据。以往对PMI的研究，多侧重于对尸体现象等方面的宏观指标的观察和测量，但由于上述指标观察及检测方法受外界因素影响较大，而且易受观察者的主观经验影响，只能对死亡时间的范围进行粗略推测。酶组织化学、尸体化学成分变化曾是死亡时间研究的一个热点，特别是玻璃体钾离子含量与死亡时间的相关性。由于各研究报道中的环境温度、检测方法、死后观察时间等因素不同，其结果差异较大，在法医学实践中存在一定的学术分歧。因此，到目前为止，尚无公认的简易实用、准确可靠的方法。近年来，随着分子生物学、图像分析技术的发展，国内外已经开始尝试通过检测细胞核DNA的变化进行死亡时间推断的研究。DNA是生物细胞核内较稳定的物质之一，同一物种不同个体、不同组织细胞内核DNA平均含量基本相同。个体死后，各种损伤因素均可破坏细胞稳态，使胞浆内溶酶体酶释放并被活化，致细胞自身消化，结构解体，细胞核DNA也逐渐发生降解。故机体死后一段时间，细胞核DNA会发生分解、减少直至消失。国内外已有学者利用流式细胞仪对死后细胞核DNA的变化进行研究，发现死后DNA含量随死亡时间的延长而逐渐减少。但由于流式细胞仪设备昂贵、实验技术要求较高、形态学参数较少等原因而难以推广。随着图像分析及计算机技术的迅速发展及广泛应用，图像分析技术（Image Analysis Technique，IAT）的几何定量分析、形态学测量功能，以及部分高端图像分析仪器的灰度定量和测量精度已经达到了流式细胞仪检测水平，因此，国内学者应用图像分析系统对动研究物死后DNA下降与死亡时间的相应性研究，其结果与流式细胞仪检测结果一致。由于上述研究中各脏器受到内外环境的影响不同，DNA的死后降解规律也有所差异。选用受环境影响小的脏器组织研究DNA的死后降解与PMI的关系将有利于提高结果的可靠性。视网膜处于相对密闭的眼球内，并且其血管稀少，死后较长时间内可以免受外环境因素的影响。所以运用IAT分析死后视网膜组织细胞DNA的降解，将有可能更好的验证IAT在PMI推断的中的应用价值。【目的】本研究在前期实验研究的基础上，重点研究死后不同时间大鼠视网膜细胞核DNA含量和形态学变化规律，以探讨死后不同时间视网膜组织细胞核DNA降解与死亡时间的关系。【方法】选用90只成年健康雌性SD大鼠，随机分成15组，20℃，死后0～28h内，每2小时提取视网膜细胞作为实验对象，细胞学涂片、冷carnoy液固定、Feulgen-Vans染色，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统，对涂片进行图像采集，并测量视网膜细胞核的异形指数、积分光密度和平均光密度等指标，运用SPSS12.0软件对测量数据进行线性回归统计学分析。【结果】视网膜细胞核的平均光密度和积分光密度随死亡时间的延长逐渐下降，异形指数则呈上升的趋势。为了更好的体现视网膜细胞核DNA的含量与PMI的相关性，本实验对每个参数的测量均值进行了简单线性回归模型的建立，得出了28h内各参数变化的回归方程如下：（1）死后28h内PMI关于视网膜细胞核积分光密度（IOD）的线性拟合回归方程：Y_IOD=-0.097X_IOD+18.903，R²=0.968（2）死后28h内PMI关于视网膜细胞核平均光密度（AOD）的线性拟合回归方程：Y_AOD=-0.009X_AOD+0.590，R²=0.949（3）死后28h内PMI关于视网膜细胞核异形指数（ID）的线性拟合回归方程：Y_ID=0.122X_ID+2.246，R²=0.951通过对PMI与三个参数的关系建立简单线性回归模型分析，发现三个方程的拟合度均较好。比较三个拟和方程的判定系数R²，PMI与积分光密度（AOD）的线性回归模型判定系数最大，说明PMI与AOD的线性关系最好。【结论】（1）本实验首次利用计算机图像分析技术，对大鼠死后28小时视网膜细胞核DNA的降解与死亡时间的关系进行了研究，结果与以往国内外学者选择的其它组织细胞核DNA死后变化规律相一致，即机体死后视网膜细胞核DNA含量也随着死亡时间的延长而呈规律性降解，并且与PMI具有良好的相关性。应用IAT测量机体死后DNA含量的变化将会成为一种较精确、客观推断死亡时间的新方法。（2）视网膜处于相对密闭的眼球内，受外界环境因素影响小，细胞核DNA在死后28h内的降解与PMI的线性关系较好。视网膜组织是早期死亡时间推断研究的较为理想的实验对象。（3）异形指数、积分光密度和平均光密度变化等参数与PMI的线性回归模型的拟合度较好，是研究死后28h内细胞核DNA降解规律、推断早期死亡时间较好的检测指标。（4）PMI与三个参数的简单线性关系回归模型的可靠性有待今后在人尸体检案实践中进一步验证。IAT测量机体死后DNA含量是一种客观、有效的推断死亡时间的实验方法，在法医实践中可结合其他死亡亡时间推断方法进行综合评价。第二部分复合荧光RT-PCR技术测量死后大鼠视网膜mRNA的降解变化【背景】随着分子生物学的发展和检测手段的更新，时间依赖性的核酸降解逐渐成为注意的焦点。体细胞核DNA是具有显著生化稳定性的遗传物质，在死后较长时间内比较稳定。国内外法医学者运用不同方法对不同组织细胞DNA降解与死亡时间的关系做了大量的研究，认为机体死后细胞核DNA降解与死亡时间（postmortem interval，PMI）存在相关性，采用合适的方法检测死后核DNA含量的变化是一种客观、有效的PMI推断方法。相对于DNA而言，一般认为RNA在活体和死后会迅速降解，这是由于普遍存在着核糖核酸酶的活性作用。然而，许多研究报道在某些肌体组织器官如脑内，RNA具有相当高的稳定性，可在死后较长时间内不被降解。mRNA的相对稳定性使研究mRNA的死后降解和PMI的关系成为可能。国内外仅有少数文献报道mRNA的降解和PMI关系，认为死后不同组织mRNA的降解与PMI存在相关性，采用合适的mRNA检测方法是研究mRNA与死亡时间关系的重要前提。【目的】半定量检测死后大鼠视网膜细胞mRNA的死后降解，进一步研究mRNA的降解和PMI的关系，为运用mRNA推断死亡时间提供基础研究。【方法】选用60只健康成年SD大鼠，雌性，体重250g±10g，按照PMI不同，随机分为15组（每2h一组）。提取死后0～28h组的大鼠视网膜作为实验对象，RRIzol法抽提组织样本总RNA，分光光度法测量总RNA的吸光度值，一步法复合荧光RT-PCR逆转录扩增管家基因（housekeeping gene）、即beta肌动蛋白（β-actin）、核糖体蛋白L4（Ribosomal protein L4，Rpl4）和磷酸甘油酸脂激酶—1（Phosphoglycerate kinase-1，Pgk1）mRNA，ABI 3100型DNA自动分析仪激光诱发荧光毛细管凝胶电泳分析PCR产物，GeneMapperv3.2软件自动测量电泳结果。运用SPSS12.0软件对各组数据与PMI的关系进行回归分析和方差检验，比较三个管家基因mRNA随PMI的降解程度，并于DNA的死后降解（第一部分结果）对比，分析mRNA推断PMI的可靠性。【结果】死后28h内，大鼠视网膜细胞总RNA的吸光度随着PMI的延长而降低。β-actin、Pgk1、Rpl4基因mRNA的RT-PCR产物，均随PMI的延长而呈下降趋势，且与总RNA的降解程度具有相似性。28h时三个基因mRNA仅能检测少量的扩增产物。28h内，PMI关于三个基因mRNA的降解的线性拟合回归方程如下：（1）PMI关于β-actin基因mRNA的线性拟合回归方程：Y_β-actin=-4436.205X_β-actin+127581.7（R²=0.976）（2）PMI关于pgk1基因mRNA的线性拟合回归方程：Y_pgk1=-1993.884X_pgk1+57651.54（R²=0.973）（3）PMI关于rpl4基因mRNA的线性拟合回归方程：Y_rpl4=-1189.791X_rpl4+34533.46（R²=0.955）三个回归方程的判定系数R²均大于0.9，表明PMI于三个基因mRNA的线性关系的拟合度较好。回归模型经方差检验有显著的统计学意义（P＜0.001），三个基因mRNA的死后降解与PMI存在线性相关关系。对比PMI关于三个mRNA的回归方程与PMI关于DNA的三个参数回归方程，其判定系数均处于较高水平，PMI与mRNA降解的相关性甚至要优于与DNA的降解相关性。【结论】（1）本实验首次利用复合荧光RT-PCR和毛细管电泳分析技术对大鼠死后28小时视网膜细胞mRNA的降解进行了研究，结果表明，机体死后视网膜细胞mRNA的含量随着死亡时间的延长而逐渐降解，并且与PMI具有良好的相关性。应用合适的定量分析方法测量机体死后细胞mRNA含量的变化，将会为PMI的推断提供新的研究方向。（2）视网膜处于相对密闭的眼球内，受外界环境因素影响小，细胞核mRNA在死后28h内的降解与PMI的线性关系较好，但与其他组织相比，降解速度较快。因而视网膜组织是研究mRNA的降解与早期死亡时间关系的良好选材。（3）实验选用的三个管家基因β-actin、Pgk1、Rpl4 mRNA的死后降解速度基本一致，并且与总RNA的降解速度相似，提示管家基因mRNA可能具有相似的死后降解规律。（4）死后28h内三个管家基因mRNA的死后降解与PMI的线性回归模型的拟合度较好，提示管家基因mRNA的死后降解，是推断早期死亡时间较好的检测指标。（5）PMI与mRNA的简单线性关系回归模型，能较好的体现死后28h内视网膜细胞核mRNA的含量与PMI的相关性，其可靠性有待今后在其他动物组织、人体中进一步验证。（6）mRNA死后降解的回归模型与DNA死后降解的回归方模型均具有良好的线性拟合度。运用mRNA的死后降解推断PMI具有可靠性，联合应用DNA和RNA的死后降解推断死亡时间，将会很大程度的提高结果的可靠性和精确度。