论文部分内容阅读
目的:探讨α-Synuclein过表达对N2A细胞内相关蛋白表达和功能的影响以及对转基因小鼠相关蛋白表达的影响。方法:(1)构建帕金森病体外细胞模型:利用脂质体将野生型α-Synuclein-pEGFP重组质粒转染进N2A细胞,通过G418筛选获得稳定克隆,并通过Western blot和免疫细胞化学鉴定目的基因α-Synuclein-GFP在细胞中的稳定表达(2)观察α-Synuclein过表达对N2A细胞蛋白表达的影响:分别以稳定过表达α-Synuclein的N2A细胞株(α-Syn-N2A)作为实验组和相同传代次数的野生型N2A细胞株(N2A)作为实验组和对照组,用不同的抗体标记蛋白,通过Western blot法检测实验组和对照组蛋白表达量的差异(3)观察α-Synuclein过表达对N2A细胞功能的影响:通过MTT法检测实验组和对照组细胞存活率的差异。观察添加6-OHDA、NH3CL/LEUPEPTIN、AMP-Deoxynojirimycin、NMDA和MK-801对实验组和对照组细胞存活率的影响(4)测量实验组和对照组全细胞葡萄糖脑苷脂酶的活性;纯化细胞溶酶体,测量实验组和对照组细胞溶酶体内葡萄糖脑苷脂酶的活性;运用NMDA以及MK-801处理细胞后,检测细胞溶酶体内葡萄糖脑苷脂酶的活性变化(5)用NMDA和6-OHDA处理细胞后,用α-Synuclein抗原标记细胞,用免疫细胞化学检测细胞内α-Synuclein的聚集情况(6)运用Western blot法检测转基因小鼠纹状体和中脑黑质内不同蛋白以及其不同位点磷酸化的表达情况。结果:(1)帕金森病细胞模型的成功构建:α-Synuclein-pEGFP重组质粒成功转染N2A细胞系,通过400μg/ml的G418筛选获得阳性克隆,Western blot和免疫细胞化学结果表明目的基因α-Synuclein-GFP在α-Synuclein-pEGFP重组质粒稳定表达组表达水平明显高于对照组,证实稳定表达野生型α-Synuclein的细胞模型构建成功(2)Western blot显示稳定细胞系Tyr1472-NR2B、Ser896-NR1和caveolin-1表达水平高于对照组而葡萄糖脑苷脂酶低于对照组(3)MTT法显示α-Synuclein稳定细胞系存活率低于对照组;随着6-OHDA的浓度递增,细胞的存活率递减,在30μM处两组细胞间细胞存活率差异有统计学意义;α-Synuclein稳定细胞系可加大NDMA所介导的细胞毒性,NMDA受体拮抗剂MK-801可以反转NMDA的细胞毒性;对照组细胞对AMP-Deoxynojirimycin+6-OHDA所介导的细胞毒性更加敏感(4)全细胞葡萄糖脑苷脂酶活性实验组稍高于对照组;而纯溶酶体内葡萄糖脑苷脂酶活性实验组要远低于对照组(大约降低50%);NMDA处理后可进一步降低溶酶体内葡萄糖脑苷脂酶的活性(5)实验组内α-Synuclein聚集高于对照组;6-OHDA和NMDA处理可使实验组α-Synuclein聚集进一步增多。(6)α-Synuclein过表达转基因小鼠纹状体内α-Synuclein、Ser831-GluR1、Ser845-GluR1、Ser896-NR1、Ser897-NR1、Tyr1472-NR2B、Ser1303-NR2B表达高于对照组,葡萄糖脑苷脂酶和Tyr125-α-Synuclein低于对照组(7)α-Synuclein过表达转基因小鼠中脑黑质内α-Synuclein、Ser87-α-Synuclein、小窝蛋白-1、Ser896-NR1、Ser897-NR1、Tyr1472-NR2B、Ser1303-NR2B表达高于对照组,葡萄糖脑苷脂酶和Tyr125-α-Synuclein低于对照组。结论:(1)α-Synuclein过表达的N2A细胞模型构建成功(2)α-Synuclein过表达使细胞内NMDA受体的磷酸化水平高增高、小窝蛋白-1增高以及葡萄糖脑苷脂酶表达降低(3)α-Synuclein过表达可以降低细胞存活率;细胞的存活率随6-OHDA浓度增加而下降,α-Synuclein过表达对6-OHDA介导的细胞毒性更加敏感;NMDA对细胞的毒性随剂量的增加而加大,α-Synuclein过表达可以加大NMDA所介导的细胞毒性;相反对照组细胞对AMP-Deoxynojirimycin结合6-OHDA的细胞毒性更加敏感(4)6-OHDA和NMDA可增加实验组细胞α-Synuclein的病理性聚集(5)α-Synuclein过表达可以降低细胞溶酶体内葡萄糖脑苷脂酶活性,NMDA可以进一步降低溶酶体内的葡萄糖脑苷脂酶活性(6)在活体纹状体和中脑黑质区,α-Synuclein过表达转基因小鼠α-Synuclein的磷酸化调节紊乱和谷氨酸受体普遍过磷酸化。