三叶木通籽油制备及创伤修复研究

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三叶木通(Akebia trifoliate(Thunb.)koidz)为木通科(Lardizabalaceae)木通属(Akebia)落叶木质藤本植物,广泛分布于我国湖南、四川等地。三叶木通果实中种籽数极多,约占鲜果重的15%,籽中含油率最高可达43%,在民间有应用三叶木通籽油促进伤口愈合、预防瘢痕形成的实例,效果显著,但功效性尚未有科学认证,目前多被作为废弃物处理。本文以三叶木通籽油的创伤修复功效为切入点,研究了它的提取工艺及精深加工,测定了不同处理方式籽油的理化性质、脂肪酸组成及氧化稳定性,同时从自由基清除、细菌抑制及体外药效学方面进行了创伤修复研究,主要结论如下:(1)确定了三叶木通籽油的最佳提取及精制工艺。三叶木通籽干热法预处理后,比较了压榨法、超声波提取法、索氏提取法、水酶法、三相法、超临界CO2萃取法等不同提取方法对三叶木通籽油得率的影响,综合得率和外观评价确定采用超临界CO2萃取法进行籽油的提取,通过响应面分析确定最优提取工艺为提取时间100 min、萃取釜压力28 MPa、萃取釜温度34℃,在此条件下,得率为36.87%。所得籽油为淡黄色透明澄清液体,具有三叶木通籽油固有的气味,无异味。精制最佳工艺为(1)脱胶:磷酸添加量0.3%,水分添加量5%,脱胶时间为30min,脱胶温度60℃,脱磷率最高可达84.37%;(2)脱酸:碱液浓度10%,超碱量0.25%,碱炼时间为40 min,温度60℃,脱酸率可达98.91%;(3)脱色:活性白土添加量5%,脱色时间35 min,脱色温度70℃,脱色率可达83.46%。精制后籽油磷脂含量降低,酸价明显下降,颜色变浅,澄清透明,无异味。Schaal烘箱法对籽油的稳定性研究表明,抗氧化剂的加入对籽油的氧化稳定性有重要影响,其中以TBHQ效果最佳,为解决保存过程中易氧化的问题打下基础。(2)依照国标比较了未处理籽油、干热处理籽油、精制处理籽油的理化性质、脂肪酸组成及氧化稳定性。结果表明虽然不同处理方式下的三叶木通籽油存在一定差异,但总体指标都很突出,高于标准(QB/T 4079-2010,GB 2716-2018)。试验发现,干热处理及精制后的籽油理化性质更好,更适于籽油的应用。采用气相色谱法对籽油的脂肪酸组成进行分析,并与其他植物籽油进行对比发现三叶木通籽油不饱和脂肪酸占比较高,而饱和脂肪酸中以棕榈酸含量最高,达到20%以上。同时采用Schaal烘箱法研究了三叶木通籽油的氧化稳定性。(3)从自由基清除、抑制细菌生长及体外药效学研究方面阐释了三叶木通籽油在创伤修复上的作用。对未处理籽油、干热处理籽油、精制处理籽油三种样品进行了体外抗氧化活性检测,以VC、BHT为阳性对照,考察籽油对DPPH·、·OH、ABTS+·的清除能力。在试验浓度范围内,三叶木通籽油对不同自由基的清除能力随浓度的增加逐渐增强,具有明显的量效关系。通过拟合曲线计算IC50得出干热处理籽油抗氧化活性最佳,精制处理籽油抗氧化活性最差,但对自由基的清除效果均差于Vc、BHT。研究表明未处理、干热处理、精制处理和压榨处理四种处理方式的籽油均具有良好的广谱抑菌活性,同时也具有一定的杀菌效果,其中以压榨处理籽油效果最佳,精制处理籽油效果较差,四种处理方式的籽油抑菌活性均较阳性对照硫酸庆大霉素差;金黄色葡萄球菌对籽油的敏感性要高于大肠杆菌和铜绿假单胞菌。采用CCK-8试验、迁移试验、小管形成试验和巨噬细胞极化试验,评判未处理籽油、干热处理籽油、精制处理籽油、压榨处理籽油四种样品对细胞毒性及增殖活性、迁移活性、血管形成活性及细胞炎性的影响。结果表明,一定浓度范围内的三叶木通籽油对HaCaT、HUVEC细胞无毒性作用,具有较好的细胞相容性。且0.01、0.1、1μL/m L浓度的籽油溶液对HaCaT有显著的增殖作用,0.001、0.01、0.1μL/m L浓度的籽油溶液对HUVEC有显著的增殖作用;同时对细胞的迁移具有一定的积极作用,且具有剂量依赖性;对血管形成也具有一定的积极作用,并以压榨处理籽油、干热处理籽油对血管形成的节点数和成管长度提高作用最为明显,且总体上以0.01μL/m L籽油浓度最为适宜。同时,籽油能够促使巨噬细胞极化为M2型,抑制巨噬细胞的过度炎性反应,保护伤口不因炎症反应而减缓愈合。
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