研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统、多器官、临床表现复杂、病程迁延反复的自身免疫性疾病,对患者的身心健康造成较大危害,是一个重要的公共卫生问题。尽管SLE的发病机制未完全阐明,但已有的证据表明,疾病的发病与遗传因素和环境因素相关,引起机体免疫异常,尤其是免疫细胞表达和(或)功能紊乱:如对自身抗原的耐受失衡,自身反应性的T淋巴细胞和B淋巴细胞活化紊乱,细胞因子功能发挥失控以及针对抗双链DNA、核小体、核蛋白的自身抗体过度产生。由此导致的自身反应性抗体大量聚集会引起补体活化、免疫复合物沉积,最终引起组织和(或)器官损伤。树突状细胞(dendritic cell,DC)广泛表达于体内,通常起着免疫监视、抗原递呈和免疫耐受的作用。DC作为特殊的“哨兵细胞”,在固有免疫与适应性免疫间起着重要的桥梁作用。DC表达特殊的模式识别受体,如Toll样受体,C型凝集素受体,RIG-I样受体以及NOD样受体。DC通常可以分为两大类:浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC,p DC)和常规树突状细胞(conventional DC,c DC)。DC的模式识别受体通过结合到微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)或者内源性分子的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs),以捕获抗原。当DC成功捕获抗原后,DC将历经成熟:(1)上调表面分子和共刺激分子的表达;(2)启动和调节T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能;(3)分泌一些细胞因子,从而调控和极化其他效应分子的功能。DC可以通过几种方式影响SLE的发病,如递呈自身抗原给自身反应性T淋巴细胞,产生促炎性细胞因子。SLE与MHC单倍体显著相关,表明T淋巴细胞应答在疾病的形成中发挥重要作用。有研究发现狼疮鼠体内TLR7过表达会加剧疾病的发生、发展,这一过程与固有刺激启动相关,并且完全依赖于MHC单倍型,提示DC可能参与了递呈染色质和RNA相关的蛋白质给自身反应性T淋巴细胞。活化的c DC能产生IL-12p70,而IL-12p70会促进T淋巴细胞中IFNγ的形成,这将导致初始T淋巴细胞分化成Th1细胞;p DC能产生I型干扰素,而I型干扰素会促进c DC成熟,降低使Toll样受体活化的阈值。因此,DC在SLE发病中可以通过影响炎症性细胞因子的产生而起作用。活性氧(reactive oxygen species,ROS)包括很多分子实体,如非自由基氧化剂H2O2,NO衍生的过氧亚硝酸盐,或者含未成对电子的自由基,如羟基自由基、NO和超氧。细胞内的NADPH氧化酶在受到外界刺激后会产生ROS,胞内物质如过氧化物酶和线粒体在氧代谢时所产生的生化反应也会产生ROS。已有研究表明,ROS对信号转导通路发挥直接作用,从而对细胞运动、分化和凋亡产生重要影响。ROS能够诱导DC成熟,影响DC分泌促炎性细胞因子。DC内含有像NADPH氧化酶那样发挥作用所需的物质。当DC与微生物成分或同源T淋巴细胞相互作用时,DC产生ROS。因此,ROS可能作为DC的内源性调节体影响DC的功能发挥。已有报道,ERK(extracellular regulated protein kinases)通路是MAPK通路中高度保守的通路,参与了多种细胞功能的发挥。ERK及其磷酸化的形态、ROS在SLE中表达异常,与疾病活动度相关,但现有的研究并未揭示单核细胞来源的树突状细胞(monocytes-induced dendritic cells,mo DC)中磷酸化的ERK(phosphorylation of ERK,p ERK)、ROS表达是否异常,mo DC分泌的炎症性细胞因子是否异常,p ERK的表达是否与ROS相关,炎症性细胞因子的分泌是否与ROS相关,ROS会否经p ERK通路影响炎症性细胞因子的分泌。此外,本研究将探讨mo DC的抗原递呈能力,以Th17细胞分化为例,推测其抗原递呈能力是否改变,且是否与ROS相关。这些研究将增进对mo DC内ROS表达和(或)功能的了解。第一部分SLE患者外周血单核细胞来源的树突状细胞内ROS表达研究目的从人外周血中提取出单核细胞诱导成树突状细胞后,比较SLE患者(新发病例,病情稳定期病例)和正常对照的树突状细胞内ROS表达水平差异,以探索ROS与SLE之间的关联。方法在获取研究对象知情同意后采用自行设计的问卷进行调查,同时抽取15ml抗凝外周静脉血,经淋巴细胞分离液分选出外周血单个核细胞,通过磁珠分选的方法提取出单核细胞,经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养7天,测定mo DC内ROS表达水平:收集SLE病例20例(新发病例11例,病情稳定期病例9例),健康对照20例;病例和对照组各分为LPS刺激组和未刺激组。或从人外周血中分离出单核细胞后,经含SLE血清的培养基培养7天,测定mo DC内ROS表达水平:收集SLE病例10例(新发病例5例,病情稳定期病例5例),健康对照10例;病例和对照组各分为LPS刺激组和未刺激组。采用SPSS10.01软件对数据进行统计分析。病例与对照数据进行比较时,符合正态分布且方差齐者采用t检验,不符合正态分布者采用Man-Whitney U检验。以P<0.05作为统计学差异的标准。结果(1)经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养mo DC时:20例SLE病例均为女性;20例健康对照中,女性19例、男性1例。病例组平均年龄为32.0±7.9岁(年龄分布从20到44岁);健康对照组平均年龄为34.1±12.8岁(年龄分布从22到59岁)。①健康对照与病情稳定期病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.402;moDC经LPS刺激时,P=0.566。②健康对照与新发病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.358;mo DC经LPS刺激时,P=0.670。③不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体,与健康对照做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.194;mo DC经LPS刺激时,P=0.646。④考虑LPS刺激前后对健康对照或SLE病例自身mo DC的影响:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与病情稳定期病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.441;健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与新发病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.075。不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即所有健康对照与所有SLE病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.062。(2)经含SLE血清的培养基培养mo DC时:10对SLE病例和健康对照中,女性均为9例、男性各1例。病例组平均年龄为33.3±9.1岁(年龄分布从20到48岁);健康对照组平均年龄为32.7±8.9岁(年龄分布从23到48岁)。①健康对照与病情稳定期病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.064;mo DC经LPS刺激时,P=0.834。②健康对照与新发病例做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.530;mo DC经LPS刺激时,P=0.292。③不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体,与健康对照做比较时,mo DC未经LPS刺激,ROS表达水平在两者间比较的P=0.791;mo DC经LPS刺激时,P=0.496。④考虑LPS刺激前后对健康对照或SLE病例自身mo DC的影响:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/病情稳定期病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与病情稳定期病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.447;健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/新发病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即健康对照与新发病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.293。不考虑疾病活动度,将病情稳定期病例与新发病例合为一体:健康对照未经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例未经LPS刺激的ROS表达水平,与健康对照经LPS刺激的ROS表达水平/SLE病例经LPS刺激的ROS表达水平做比较,即所有健康对照与所有SLE病例经刺激前后的比值间的比较,P=0.821。结论本研究表明:SLE病例与健康对照外周血单核细胞来源的树突状细胞,其ROS表达水平在两组间无显著性差异。第二部分ROS与树突状细胞炎症性细胞因子分泌的关联研究目的比较SLE患者(新发病例)和正常对照的树突状细胞内p ERK表达水平及分泌的炎症性细胞因子差异。分析ROS与p ERK及炎症性细胞因子间的关联。方法经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)、含SLE血清的培养基两种方法培养新发病例与健康对照的mo DC时(前者为11对,后者为5对),收集上清液,-80℃冻存留待检验。采用ELISA试剂盒检测上清液中与Th1,Th2,Th17相关的炎症性细胞因子IL-2,IL-6,IL-10,IL-17的表达水平。新发病例和健康对照各分为LPS刺激组和未刺激组。此外,收集经完全培养基和诱导剂(rh GM-CSF+rh IL-4)培养的新发病例与健康对照的mo DC(11对,未经LPS刺激),裂解细胞,经蛋白质印迹法(Western blot)检测病例组与对照组间p ERK表达水平。分析ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、p ERK表达水平之间的关联。本研究所采用的病例组、对照组细胞来自于第一部分培养的细胞。数据的分析采用SPSS10.01软件进行,以α=0.05为检验水准。结果(1)两种方法培养mo DC时,新发病例与健康对照的mo DC,无论经LPS刺激还是未刺激,IL-2、IL-6、IL-10、IL-17的表达水平在二者间均无统计学差异(P>0.05)。(2)经完全培养基和诱导剂培养mo DC时,新发病例组与健康对照组的mo DC未经LPS刺激,p ERK表达水平在病例组中明显低于健康对照组(P=0.031)。(3)ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、pERK表达水平间均无显著性关联(P>0.05);此外,p ERK表达水平与炎症性细胞因子表达水平间无统计学关联(P>0.05)。结论本研究发现:与Th1,Th2,Th17相关的炎症性细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-17在新发病例与健康对照间无统计学差异,但p ERK表达水平在新发病例组中明显低于健康对照。然而炎症性细胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IL-17)的分泌可能与ROS无关联。第三部分ROS与树突状细胞抗原递呈能力关联探讨,以Th17分化为例目的将新发病例与健康对照的单核细胞培养成树突状细胞(mo DC),然后分别与健康对照的CD4+T细胞进行共培养,以探讨mo DC的抗原递呈能力,以Th17分化为例。分析ROS表达水平与Th17分化间的关系,以推测mo DC抗原递呈能力的改变是否与ROS相关。方法新发病例和健康对照的单核细胞经含SLE血清的培养基培养4天(新发病例和健康对照各5例);获mo DC后,分为不同的浓度组,再与健康对照(同一人)的T细胞(浓度恒定)进行共培养6天,然后用ELISA法检测上清液中与Th17分化相关的炎症性细胞因子TGF-β、IL-6的表达水平;流式细胞仪检测Th17细胞的表达水平在二者间的差异。分析ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、Th17细胞表达水平的关联。本研究所采用的病例组、对照组细胞来自于第一部分培养的细胞。数据的分析采用SPSS10.01软件进行,以α=0.05为检验水准。结果(1)新发病例、健康对照的mo DC,分别与同一健康对照的CD4+T细胞共培养后,TGF-β、IL-6的表达水平在二者间无统计学差异(P>0.05)。(2)新发病例、健康对照的mo DC,分别与同一健康对照的CD4+T细胞共培养后,Th17细胞的表达水平在二者间无统计学差异(P>0.05)。(3)ROS表达水平与炎症性细胞因子表达水平、Th17细胞表达水平间均无显著性关联(P>0.05)。结论本研究表明:mo DC的抗原递呈能力在病例组与健康对照组间无显著性差异(以Th17研究为例),mo DC抗原递呈能力的变化(诱导Th17分化)可能与ROS无关。