尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界性养殖鱼类,雄鱼比雌鱼生长快50%,养殖全雄鱼具有更好的经济价值。尼罗罗非鱼具有XX/XY型性别决定系统,其性别主要由遗传因素决定,环境因子影响较小,且基因组测序已经完成并公开,是一种研究性别决定与分化的好模型。长期以来,国际上不少研究小组在尼罗罗非鱼性别决定与分化分子机制方面做了大量的研究,一直致力于确定其性染色体并克隆其性别决定基因。对不同家系尼罗罗非鱼的研究表明,遗传连锁群LG1、LG3和LG23所对应的染色体均有可能是性染色体,但到底哪一个LG所对应的染色体才是性染色体还没有定论,至今也没有克隆到尼罗罗非鱼性别决定基因。虽然已有尼罗罗非鱼性别连锁分子标记的报道,但所获得的标记多为性别连锁的AFLP、SS R或SNP标记,特异性不强,因而遗传性别的快速鉴定问题始终没有得到解决,至今还没有建立分子标记辅助选育遗传全雄尼罗罗非鱼技术。因此,以罗非鱼为材料,筛选获得性别特异分子标记,进而开展有关性别决定与分化以及性别控制方面的研究,可以同时兼顾基础与应用研究两个方面。本研究采用RAPD、AFLP和PCR随机扩增性别决定区间三种方法筛选到5个X或Y染色体特异的分子标记,通过荧光原位杂交实验结合最近公开的全基因组序列,初步确定LG23所对应的染色体就是其性染色体。在筛选获得的多个性别特异的分子标记的基础上,通过遗传连锁分析进一步缩小性别决定区间,原位克隆到了尼罗罗非鱼性别决定候选基因sdY,并通过一系列实验加以证实。主要研究结果如下：1.采用RAPD结合分离群体分析方法,选取1200条RAPD随机引物对XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼基因组池进行筛选,有152条引物在基因组池水平扩增出性别差异条带。经不同遗传性别的个体水平验证后,筛选出13条标记可能跟性别相连锁。将目的条带亚克隆测序,序列分析发现绝大多数序列为重复序列,无法将这些标记转化为能稳定扩增的SCAR标记,仅有S1368 (Marker-1)转化来的标记SCAR-1具有明显而稳定的性别特异性。在基因组中能扩增出两条带,一条长为740 bp,为XX、XY和YY共有,另外一条长为648 bp,仅在XY和YY个体中扩增出来,而在XX个体中没有扩增,是Y染色体特异的条带。将这两条条带亚克隆测序,序列比对分析发现Y特异条带较X和Y共有的条带有92 bp碱基序列的缺失,该标记是一个Y染色体特异的分子标记,位于LG23的Scaffold29上。2.采用AFLP结合分离群体分析方法,应用160种引物组合对XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼基因组池进行筛选。选取15对扩增条带清晰、且有X或Y染色体特异的引物组合作进一步研究。引物组合M1X3 (Marker-2)能扩增出一条Y染色体特异的条带,而44X7 (Marker-3)能扩增出X染色体特异的条带。M4X13 (Marker-4)将特异条带亚克隆测序分析,经与尼罗罗非鱼基因组和遗传连锁图谱比对分析,发现和Marker-2位于LG23的Scaffold7上,Marker-3位于LG23的Marker-49上。Scaffold2通过将这三个特异序列与基因组序列比对,获得其上下游序列信息,设计基因特异引物对不同遗传型个体基因组进行PCR扩增。引物和XY个体中扩Marker-2F/R在XX增出675 bp的条带,同时在XY和YY个体中扩增出一条669 bp的条带；引物XX和XY个体中扩增出一条763 bp的条带,同时在XY和YY个体中扩Marker-3F/ R在增出一条770 bp的条带。引物生XX和XY个体中扩增出一条980 bp的条Marker-4F/1 R带,同时在XY和YY个体中扩增出一条620 bp的条带。扩增片段测序后比对分析发现,X序列比Y序列有5～10个鸟嘌呤碱基重复,同时还有一处Marker-2碱基多态性差异。X-CT/Y-TC序列比X序列多了7 bp碱基序列插入。Marker-3 Y特异Marker-4 Y序列与X序列相比缺失了360 bp碱基序列。这三个标记均被成功转化为SCAR标记。3.近年来,以色列研究小组报道尼罗罗非鱼性别决定区间位于LG23的上。同时,经与基因组比对分析发现,我们筛选获得的4个分子标记位于Scaffold101基因组和3)和29Scaffold7 (Marker-2和4)上,紧令(Marker-1。因此,Scaffold101在LG23上和Scaffold7、29101所在区间共设计了32对普通引物,采用PCR随机扩增性别决定区间结合分离群体分析方法,对和YY鱼基因组DNA进行扩增。XX、XY扩增结果发现,引物Marker-5F/R具有明显的性别特异性,命名为5,该引物Marker-能在XX和XY个体中扩增出1151 bp的X染色体特异条带,同时在XY和YY个体中扩增出一条711 bp的Y染色体特异条带。其余31对引物扩增图谱没有性别特异性。将x和Y染色体特异条带亚克隆测序,序列分析发现,X和Y序列主要有3个位置的差异。在P1处,Y序列插入了36 bp碱基；在P2处,Y序列缺失了4 bp碱基序列；在P3处,Y比X序列缺失了472 bp碱基。通过在序列差异处设计只扩增X或Y染色体的特异引物,成功转化为SCAR标记,该标记能够用于遗传性别的鉴定。4.对和XX (♀) × XX (♂)、XX (♀) × XY (♂)、 XX (♀) × YY(♂)、XY (♀) × XY(♂))繁殖后代进行遗传性别与表型性别鉴定,证明我们筛选到的分子XY(♀)×YY(♂标记具有很好的性别特异性。同时,为了检测筛选获得的性别特异分子标记对其他家系尼罗罗非鱼也适用,我们对8种不同来源NG和TH)共215尾尼罗罗非鱼进行表型性别与遗传性别双盲鉴定,吻合率为(HN、HN1、HN2、T1、T2、THS、75%～100%,吻合率最低的是T1家系为75%,最高的是HN家系为100%。应用筛选获得的性别特异分子标记,我们建立了快速、准确的尼罗罗非鱼遗传性别PCR鉴定方法,并辅助建立了分子标记辅助选育技术。该技术的建立,将有可能为全雄罗非鱼鱼苗的繁育提供技术支持。应用分子标记对3个XX (♀) XX(♂)家系共277尾个体进行遗传连锁分析,假设完全干扰条件下,分别计算出Marker-1、2、3、4和5距离性别决定位点的平均遗传距离分别为8、6、8、5和3 cM。在家系2中,Marker-1、2、3、4和5距性别决定位点的距离为6、4、6、3和2cM, Marker-5距离性别决定基因最近。对物理图距、遗传距离和天然性逆转率(扣除遗传重组以外的表型与遗传性别不吻合率)三个方面讨论分析后,我们进一步证实Marker-5实际上就在性别决定基因的附近。基因组比对分析结合物理图谱定位发现,我们筛选获得的五个标记全部位于LG23上。FISH结果表明,分子标记Marker-1 和Marker-3所杂交到的一对小的染色体就是尼罗罗非鱼性染色体。5.借助筛选获得的性别连锁分子标记,进一步缩小性别决定基因所在区间,结合本实验室己构建的尼罗罗非鱼基因组Fosmid微阵列文库,原位克隆到了尼罗罗非鱼性别决定候选基因sdY。序列分析发现,它是性染色体上sdX因复制后串接插入Y染色体原基因上游而成,但由于在编码区第6个外显子上有5 bp碱基序列插入,造成移码突变,产生一个截短型突变体。另外在该基因上游启动子区还有1处插入,3处缺失,在第7外显子上有233bp碱基序列缺失。采用RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆了sdY全长cDNA序列,组织分布研究发现,sdY在XY和YY性腺表达,而sdX卵巢和精巢中表达；个体发生分析表明,sdY从孵化后5天(尼罗罗非鱼性别决定关键时期)开始高表达,之后表达量降低并一直持续到成体。对XX性逆转假雄鱼的研究表明,sdX在性逆转过程中起着很重要的作用。对XY雄鱼、XY性逆转雌鱼和YY超雄鱼的研究发现,sdY基因都有表达,且始终维持在一个相对稳定的水平,充分说明saY的表达完全不受外源激素的影响,其表达完全由基因型决定而与表型无关。免疫组化研究发现,我们所制备的抗体能同时识别sdX和sdY信号,在卵巢中颗粒细胞表达以外,还在精巢中在叶边细胞和Sertoli细胞表达。我们还将通过在XX个体过表达sdY(获得功能)、在XY个体定点敲除或敲降sdY(失去功能),研究性腺组织形态、雌雄信号通路上关键基因的表达变化以及转基因个体雌激素合成等。通过正反两方面进行实验验证,确定我们筛选到的候选基因sdY就是性别决定基因。罗非鱼性别决定候选基因sdY(即总开关)的克隆,将有助于从源头上阐明其性别决定与分化的基因级联或调控网络,有助于阐明硬骨鱼类乃至脊椎动物性别决定和分化的分子机制,也有助于实现罗非鱼的的性别控制,提高水产养殖效益。