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从实验室已有菌株出发筛选得到一株木质素降解酶活较高的菌株YJ9。通过菌株的形态学特征、菌株ITS序列和18SrDNA序列同源性比对以及系统发育分析,对这株菌进行了初步鉴定。为了获得遗传性能稳定的菌株,以这株菌出发,通过原生质体技术制备单核菌株。研究了其菌丝生长培养基的类型,菌丝生长时间(菌龄),酶解时间,原生质体纯化离心速度和原生质体再生培养基类型对原生质体制备与再生的影响;采用DAPI染色和锁状联合缺失的观察,从原生质体再生株中筛选单核菌株并考察其产酶特性。进一步对此单核菌进行一系列的诱变,选育出一株木质素降解酶活提高较多的菌株3-8,并利用NaOH-H2O2与菌株3-8的酶液联合对玉米秸秆进行前处理,然后采用纤维素酶对处理后秸秆进行水解糖化。
通过形态学特征观察以及ITS序列同源性比对和系统发育分析,将菌株YJ9鉴定为毛栓菌(Trameteshirsuta)。原生质体制备结果表明:采用YGM菌丝生长培养基、88h菌龄、1h酶解时间、4000r/min原生质体纯化离心速度以及YGMS再生培养基,最终可获得密度大约为5.0×106个/mL的原生质体悬浮液和9.1%的再生率:从200株再生菌株中筛选出了3株单核菌株,其中一株单核菌株D-2-1的漆酶产量比原菌T.hirsutaYJ9明显提高,在第12d其漆酶酶活为771.67U/L,是原菌的1.51倍。
通过原生质体紫外微波复合诱变方法对菌株D-2-1进行诱变,获得了一株酶活较高的菌株3-8,其LAC在第12d为1424U/L,比出发菌株D-2-1(LAC为771U/L)提高了184.7%。进一步对菌株D-2-1和3-8的Lac同工酶进行分析,发现诱变后3-8的同工酶种类未发生变化,但与出发菌D-2-1相比,3-8的同工酶条带先产生,带宽且亮,这与诱变后菌株Lac酶活提高并提前产生的现象相符。
通过单因素实验,并结合考虑实际处理成本与能耗等,得到单独的碱氧(NaOH-H2O2)处理去除玉米秸秆木质素的较好条件:0.3%双氧水与2%NaOH溶液按体积1∶1配合,秸秆目数40目以下,温度30℃,固液比1∶15(g∶mL),处理时间18h。在此条件下,玉米秸秆木质素降解率达到77.59%。
采用NaOH-H2O2与3-8粗酶液联合处理玉米杆,得到的各组分降解率与单独的NaOH-H2O2处理相比,差别不大,这表明粗酶液的处理并没有造成秸秆组分的进一步降解,但从傅里叶红外光谱和扫描电镜分析则可以看出联合处理较单独处理对秸秆的结构造成了更大的破坏。接下来采用纤维素酶在温度为50℃、纤维素酶浓度为50FPU/g秸秆、固液比为1∶15(g∶mL)、酶解时间为72h的条件下,分别对联合处理和NaOH-H2O2单独处理玉米秸秆进行酶解。结果表明,NaOH-H2O2单独处理的还原糖得率为43.8%,联合处理还原糖得率为73.6%,较单独处理提高了40.5%。