研究背景：宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,仅次于乳腺癌,位于妇女恶性肿瘤的第二位,90年代初,WHO宣布人乳头瘤病毒(human papilloma viruses, HPV)是引起宫颈癌变的首要因素,因此,宫颈液基细胞学和HPV病毒联合检测技术明显提高了宫颈癌筛查的准确率,尤其是对早期宫颈病变的发现有很大的帮助,同时也发现宫颈癌或宫颈上皮内瘤变患者的年龄趋于年轻化,对生育和性生活质量的要求较高,传统的治疗方法包括手术、放化疗等对生殖器官功能的保留不太理想,光动力疗法可能成为一种新的能保留生育功能的治疗方法。另外,对于年龄较大的晚期宫颈癌患者,一般情况差难以耐受化疗及放疗的不良反应时,光动力治疗也成为可选择的治疗方式之一。光动力疗法(PDT)是基于病变细胞选择性的吸收光敏剂并在特定波长激光的激发下产生的光化学反应,对病变细胞或者组织产生杀伤效应。PDT现广泛应用于皮肤科、呼吸、消化、妇科等临床科室,成为近年研究的热点,但在发现PDT治疗作用的同时,也发现其副反应有时是严重的,如皮肤发生红斑、水泡等光敏性皮炎、皮肤溃疡等。我们本次实验选用的光敏剂是四甲基吡啶卟啉(5,10,15,20-tetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin, TMPyP4),属于卟啉衍生物,是一种新型的水溶性光敏剂,可以结合并稳定人类端粒G-四链体的形成,抑制端粒酶的功能,而目前研究发现恶性肿瘤增殖失控的关键在于端粒酶的激活,因此,TMPyP4通过稳定G-四链体的结构,从而降低端粒酶活性,将其作用于肿瘤细胞可导致肿瘤细胞生长停止,诱导肿瘤细胞的凋亡。但近年有研究发现,端粒酶活性在一些正常细胞中也被检测到,如外周血、骨髓细胞和皮肤的基底层等组织。因此,卟啉类光敏剂和端粒酶的相互作用可能会影响机体的正常细胞,在正常组织产生副作用。另外,TMPyP4本身是一种光敏剂,在适当波长的激光照射下可发生光敏反应,对肿瘤细胞起到杀伤作用,因此从理论基础上分析,TMPyP4是一种对恶性肿瘤细胞杀伤作用比较强的药物,但它有肿瘤选择特异性较差的缺点,在发挥治疗作用的同时也可能发生相关的光敏副反应,如皮肤溃疡、脏器损伤等,因此为了避免全身副反应的发生,我们选择在肿瘤局部用药方案。Survivin和Caspase-3是参与调节细胞凋亡的两个重要分子,Survivin是目前发现的最强的凋亡抑制因子。有研究发现,Survivin可能通过某种机制间接抑(?)Caspase-3的活性而抑制细胞凋亡,而Caspase-3是Caspase家族成员中执行细胞凋亡的重要成员之一,在细胞凋亡过程中起关键作用,大多数促进细胞凋亡的因子,最终都通过激活Caspase-3而导致细胞凋亡。目前,已有TMPyP4抑制端粒酶活性的报道,但TMPyP4-PDT对促进恶性肿瘤细胞凋亡及对凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达影响研究较少,本研究中我们通过观察TMPyP4-PDT对裸鼠Hela细胞移植瘤的作用来探讨其对宫颈癌细胞的促凋亡机制。根据我们前期细胞实验研究结果：TMPyP4-PDT对宫颈癌hela、siha细胞均有显著杀伤作用,而宫颈癌hela、siha细胞对TMPyP4-PDT的敏感性不同,宫颈癌hela细胞较敏感。因此,我们动物实验选择宫颈癌hela细胞接种雌性BALB/c裸小鼠,观察TMPyP4-PDT对裸鼠移植瘤的抑制作用。因为PDT杀伤肿瘤细胞的效果取决于光敏剂浓度和光的能量密度,我们曾用光敏剂TMPyP4的较大浓度(20mg/kg)对裸鼠宫颈癌移植瘤行瘤周注射,发现在没有激光照射的情况下就发生了皮肤溃烂,持续时间较长(四周)。预实验时我们也曾选择经尾静脉注射光敏剂给动物全身用药(10mg/kg),发现光敏剂在尾静脉中长时间聚集,避光四周,然后移至自然光线下放置2天发现裸鼠尾巴部分出现干性坏死(见图1-2),而肿瘤增大明显,生长未被抑制,裸鼠消瘦,提示全身用药治疗效果不理想。综上所述,为了较大限度的降低TMPyP4-PDT副反应,同时又能达到治疗宫颈癌的效果,我们设计多次低剂量TMPyP4-PDT的治疗方案,通过局部瘤体内用药方法来探讨TMPyP4-PDT对宫颈癌的治疗作用,并探讨其促进宫颈癌细胞凋亡的机制。第一部分：光敏剂TMPyP4多次低剂量光动力疗法治疗宫颈癌的动物实验研究研究目的：光动力疗法(PDT)是一种近年研究发现的适合治疗宫颈癌的新方法,但光动力疗法的副作用有时是严重的,为了减少光敏疗法副反应的发生,又能在较大程度上达到治疗恶性肿瘤的效果,我们设计本实验来研究观察TMPyP4多次低剂量光动力疗法对裸鼠宫颈癌Hela细胞移植瘤的治疗效果及副反应。材料与方法：雌性BALB/c裸小鼠(5-6周,称重18-20克)20只,SPF级条件饲养,裸鼠皮下注射宫颈癌Hela细胞(1×107细胞/200μL),瘤细胞接种10天后,达到标准的荷瘤小鼠为18只,标准成瘤率为90%,将荷瘤小鼠随机分为三组,每组6只(n=6),A组为对照组,无任何治疗；B组为一次用药光疗组,用TMPyP4(10mg/kg)瘤内注射和照射蓝色激光(108J／cm2)一次,药物注射与激光照射间隔时间为6小时；C组为三次用药光疗组,用TMPyP4(10mg/kg)瘤内注射和照射蓝色激光(108J/cm2)三次,每次治疗间隔时间2天。开始治疗后,监测肿瘤体积,在C组治疗结束后2周,比较各组肿瘤体积大小,同时观察裸鼠生活状态以及皮肤和组织器官的损害情况及血液中血常规和肝肾功能的变化情况。结果：C组移植瘤体积与A组和B组比较明显受到抑制(P<0.05)；而实验结束时治疗组裸鼠体重增加,生活状态良好,对照组体重下降,生活状态较差；另外治疗组裸鼠皮肤和内脏器官未见明显损伤,血常规和肝肾功能与对照组相比无明显变化,同时肿瘤切片HE染色发现C组移植瘤细胞凋亡明显增多。结论：我们的研究结果表明,多次低剂量TMPyP4光动力治疗可显著抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长、促进肿瘤细胞凋亡,治疗组裸鼠生活状态良好,未见消瘦,血常规和肝肾功能无明显变化,同时皮肤及内脏器官未见明显副反应发生。第二部分：TMPyP4-PDT对宫颈癌裸鼠移植瘤细胞凋亡及Survivin和Caspase-3表达影响的研究研究目的：细胞凋亡又称细胞程序性死亡是指为维持内环境稳定,由一系列酶参与、多种基因控制的细胞自主有序的死亡过程。细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切,目前细胞凋亡的确切机制仍不清楚,但细胞往往会激活相对立的两个过程,凋亡和抗凋亡,由两种信号通路的强弱对比决定最后的结局。所以,细胞凋亡一直是恶性肿瘤研究的热点,也是药物治疗研究的靶点。有研究发现,低剂量光敏剂光动力治疗导致细胞凋亡,而高剂量光动力疗法主要引起细胞坏死。我们采用原位末端标记法(TUNEL)研究观察TMPyP4-PDT治疗组宫颈癌细胞的凋亡情况,TUNEL法的原理是生物素或荧光素等标记物被标记在DNA缺口末端的3’-OH上,在TdT催化下,通过标记物显色系统在组织细胞原位检测凋亡细胞,对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,与普通HE染色方法相比,能更准确的反映细胞凋亡的形态特征并进行组间统计学分析对比。生存素(Survivin)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在细胞凋亡的发生机制中是两个比较关键的因子,本研究联合检钡Survivin和Caspase-3在裸鼠宫颈癌移植瘤中的表达,探讨TMPyP4-PDT促进宫颈癌细胞凋亡的机制。材料与方法：按照实验第一部分分组情况,取各组移植瘤石蜡切片,用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况,用全自动荧光显微镜进行观察和结果分析。TUNEL检测方法为每例标本随机取10个高倍视野,检测1000个细胞中凋亡细胞所占百分比计数为凋亡指数(AI)。survivin和caspase-3蛋白的检测采用免疫组化SP法,免疫组化阳性为细胞浆中棕黄色颗粒,采用全自动显微镜和图像采集分析系统,每只裸鼠选3张切片进行分析,每张切片连续读取10张高倍视野,计算每视野阳性染色的光密度(0D)值,最后计算每组裸鼠的平均光密度值进行统计学分析。结果：荧光强度检测结果显示, TUNEL阳性细胞以绿色荧光表示。TMPyP4-PDT三次治疗组的TUNEL阳性(绿色荧光)细胞较单次治疗组和对照组明显增多,凋亡指数高于另外两组,差异有显著性意义；survivin和caspase-3蛋白免疫组化检测结果显示在三次治疗组凋亡抑制因子survivin蛋白表达降低,凋亡关键因子caspase-3表达升高。结论：多次低剂量TMPyP4-PDT疗法对裸鼠移植瘤宫颈癌细胞有明显的促凋亡作用,其机制可能与survivin蛋白表达降低和caspase-3表达升高有关。