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泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是我国常见的小型经济鱼类,我国的野生泥鳅群体中不仅有二倍体（2n=50）,在长江流域,人们还发现有大量的四倍体（4n=100）。通过诱导雌核发育、雄核发育、六倍体,以及减数分裂期的染色体行为观察,研究人员推测,这些野生四倍体泥鳅为同源四倍体,是由二倍体祖先经过染色体加倍形成的。泥鳅的这种天然二倍体与四倍体共存的现象,使其成为研究多倍体鱼类的生物学和遗传学等的理想模式生物。表观遗传变异（Epigenetic variation）是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致表型的变化。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要途径之一,在生物体的基因表达、细胞分化以及系统发育过程中发挥重要的调控作用。研究发现,多倍体的产生往往伴随着广泛的DNA甲基化变异,这些变异在控制多倍体基因组中冗余基因的表达和保持基因组稳定方面起着重要的调节作用。然而,目前相关的研究主要集中在拟南芥、水稻、小麦等植物中,鱼类是脊椎动物的最大类群,其多倍体现象也非常普遍,鱼类多倍化后DNA甲基化修饰变化及其对基因表达调控的研究尚未见报道。为研究泥鳅基因组多倍化后DNA甲基化变异及其与基因表达的相关性,本研究以二、四倍体泥鳅为材料,首先,采用甲基化修饰依耐性内切酶测序技术（Methyl RAD-Seq）在全基因组水平上分析泥鳅的DNA甲基化特点以及倍性间的DNA甲基化水平及模式变异;然后,筛选倍性间DNA甲基化水平变化较大的IGFBP基因家族（IGFBPs）,克隆其全长CDS序列和启动子序列,用q RT-PCR方法分析其在二、四倍体泥鳅间的表达差异;用亚硫酸氢盐测序技术（BSP）检测二、四倍体泥鳅间第一外显子区及启动子区的甲基化水平差异,探讨倍性间的DNA甲基化差异及其对基因表达的调控作用。主要研究结果如下:1.二、四倍体泥鳅全基因组DNA甲基化的比较用Methyl RAD-Seq技术对二、四倍体泥鳅的全基因组DNA甲基化进行了测序分析。测序结果共得到302,111,684条Methyl-RAD序列标签。与参考基因组比对结果显示,泥鳅的甲基化位点主要分布在基因体区（genebody）,其次为内含子区（intron）和基因间区（intergenic）,而在其它功能元件上的分布较少。四倍体泥鳅的整体甲基化水平比二倍体高,尤其是在第一外显子区(1stExon)和转录起始位点上游1500bp至200bp区（TSS1500）,且倍性间差异极显著（P＜0.01）。但在启动子区,四倍体泥鳅的甲基化水平略低于二倍体。在二倍体和四倍体泥鳅间共筛选到1268个差异甲基化CmCGG位点和14个差异甲基CmCWGG位点,这些位点主要分布于内含子、基因体和基因间区。比较各基因的甲基化水平,共得到684个倍性间差异甲基化基因。KEGG分析结果显示,倍性间差异甲基化基因主要富集到与生长发育、免疫及错配修复等相关通路上。2.IGFBPs在二、四倍体间的表达差异及其与DNA甲基化的相关性1)IGFBPs全长CDS序列的克隆与分析通过克隆获得了二、四倍体泥鳅IGFBP-1、-2b、-5、-6b、-7的全长CDS序列,分别长789bp、801bp、795bp、633bp、768bp,其中,IGFBP-5存在2种可变剪切体,分别命名为IGFBP-5α和IGFBP-5β,长度分别为708bp和595bp;IGFBP-7存在1种可变剪切体,命名为IGFBP-7α,长度为537bp。部分基因（IGFBP-1-2b）的CDS序列在二、四倍体泥鳅间存在少量的碱基差异,但其氨基酸序列完全相同。对序列进行的生物信息学分析结果显示,泥鳅的IGFBP-1、-2b、-5、-6b、-7均属于分泌蛋白,含有保守的N-端、C-端和多变的中央L-结构域。其中,IGFBP-1、-2b、-5、-6b的N-端富含保守的半胱氨酸残基位点（Cys）、IGFBP同源域（IB）和典型的GCGCCXXC基序（除IGFBP-6b外）;C-端也富含Cys残基,此外,还存在I型甲状腺球蛋白域（TY）和典型的CWCV基序。IGFBP-7与IGFBP-1、-2b、-5、-6b结构的相似性仅限于N-端结构域,其它区域的氨基酸序列具有高度特异性。2)IGFBPs启动子序列的克隆与分析用hi TAIL-PCR技术克隆获得了IGFBP-1、-2b、-5、-6b、-7基因的启动子序列,除IGFBP-7外,其它基因的启动子上均含有典型元件TATA-box,且位于转录起始位点上游-23至-32区间。顺式作用元件分析显示,IGFBP-1启动子上潜在着CREB、GATA-2/3/4、POU2F2、C/EBPA、C/EBPB、SP1、SRY等转录因子结合位点,IGFBP-2b、-5、-6b、-7同样含有以上转录因子结合位点,同时也含有各自特有的转录因子结合位点。IGFBP-1、-2b、-5、-6b、-7的启动子序列在二、四倍体泥鳅间相似性分别为99%、93%、98%、96%和97%,该差异主要由于四倍体的序列缺失造成的。3)二、四倍体泥鳅IGFBPs的表达差异分析IGFBPs在二、四倍体泥鳅的肝脏、血液和肌肉组织中均有表达,其中IGFBP-1、-2b主要在肝脏中表达,IGFBP-5、-6b主要在肌肉中表达,IGFBP-7在肝脏和肌肉中的表达量均较高。在肝脏中,四倍体泥鳅IGFBP-1、-2b、-5、-7的表达量高于二倍体,其中IGFBP-1、-2b、-7显著高于二倍体（P＜0.05）;IGFBP-6b的表达量低于二倍体（P＞0.05）。在肌肉中,四倍体泥鳅IGFBP-1、-5、-6b、-7的表达量低于二倍体,其中IGFBP-5、-6b、-7显著低于二倍体（P＜0.05）;IGFBP-2b的表达量高于二倍体（P＜0.05）。在血液中,四倍体泥鳅IGFBPs的表达量均低于二倍体（P＜0.05）。4)二、四倍体泥鳅IGFBPs的DNA甲基化差异分析BSP分析结果显示,在肝脏中,四倍体泥鳅IGFBP-1的甲基化水平低于二倍体（P＜0.05）,IGFBP-2b、-5、-7在二、四倍体间无显著性差异（P＞0.05）;在肌肉中,四倍体泥鳅IGFBP-1、-2b的甲基化水平低于二倍体,IGFBP-5的甲基化水平高于二倍体,IGFBP-7在二、四倍体间无显著性差异（P＞0.05）;在血液中,四倍体泥鳅IGFBP-1的甲基化水平低于二倍体（P＜0.01）,但IGFBP-2b-5的甲基化水平高于二倍体,IGFBP-7在二、四倍体间无显著性差异（P＞0.05）。5)IGFBPs的表达与DNA甲基化的相关性分析在IGFBPs基因的主要表达组织中,泥鳅IGFBP-1、-2b、-5的m RNA表达量随着倍性间DNA甲基化水平的升高而降低,即表达水平与DNA甲基化水平负相关;但在非主要表达组织中,没有明显的相关性。IGFBP-6b、-7基因的表达水平与DNA甲基化无明显的关系,其表达调控机制有待进一步的深入研究。