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甲烷是瘤胃微生物的代谢终产物之一,它的产生不但是反刍动物能量损失,还是温室气体的主要来源,因此对瘤胃甲烷菌的研究成为当前热点。瘤胃古菌C簇(RCc)可能是一个新的瘤胃甲烷菌目,但目前尚未有直接的证据。为证实RCC是甲烷菌,本文尝试采用与厌氧真菌共培养的方法,从瘤胃液中富集培养RCC菌株；通过体外共培养模型研究它们的代谢特点及富集培养条件；利用荧光定量PCR研究它们在瘤胃内的分布以及它们在饲喂不同精粗比日粮的山羊瘤胃中的变化情况。实验共分五个部分：1RCC菌株LGM在厌氧真菌培养液中的丰度及其在山羊瘤胃不同部位的分布本研究建立了RCC菌株LGM的荧光定量PCR方法,对存在于厌氧真菌富集培养液以及瘤胃不同部位样品中的LGM进行了定量分析。结果显示LGM在每五天传一代的厌氧真菌富集培养液中占总甲烷菌的比例最大(P<0.05),在每三天传一代的厌氧真菌富集培养液中LGM随着传代的进行逐渐消失。对瘤胃上皮粘膜、瘤胃内容物液相和固相样品的检测结果显示LGM在瘤胃内容物液相中占总甲烷菌的比例最高(为1.34%,P<0.05)。结论：对LGM的体外富集培养可采用瘤胃液作为接种物并采用每五天传一代的传代频率。2厌氧真菌和甲烷菌共培养物的分离利用富集培养方法和厌氧滚管技术从山羊瘤胃液中分离纯化厌氧真菌与甲烷菌共培养物。经过短期传代富集培养和厌氧滚管挑菌,成功分离到了产甲烷的厌氧真菌培养物,PCR检测结果显示没有获得含有LGM的厌氧真菌培养物。形态学观察与细胞核DAPI染色结果显示培养物中的厌氧真菌均属于Piromyces.对培养物中的甲烷菌进行PCR-DGGE和16S rRNA基因序列分析,结果显示每个培养物中仅含有一株甲烷菌,并且这些甲烷菌均属于甲烷短杆菌。下面对培养物F1进行了进一步研究。荧光显微镜和扫描电镜观察结果显示在培养物F1中,甲烷菌附着在厌氧真菌的假根部。利用长期传代富集培养方法和厌氧滚管挑菌技术并结合甲烷短杆菌抑制剂的使用分离得到含有LGM的厌氧真菌培养物,测序结果显示LGM含有甲烷菌合成甲烷的关键酶基因(甲基辅酶M还原酶A)。结论：共培养方法可以分离纯化含有未培养甲烷菌的厌氧真菌培养物。3共培养方法研究瘤胃RCC菌株MGC氢营养特性本研究利用体外共培养模型研究了鸡源RCC菌株MGC的氢营养特性。首先建立起含有白色瘤胃球菌(R. albus)和甲烷菌(甲烷短杆菌或MGC)的体外共培养模型并对模型进行验证,结果显示甲烷菌的生长未对R. albus的代谢产生显著影响。模型成功建立后,首先对MG-C的底物利用特点进行了研究,发酵结果显示在甲醇和三甲胺同时存在的情况下,MGC首先利用三甲胺。接下来利用模型对MGC的氢气竞争能力进行了研究。在模型中引入一株甲烷短杆菌(M. smithii)与MGC进行氢气竞争,结果显示在模型中MGC的生长延滞期比M. smithii长,M. smithii在MGC的生长延滞期结束之前就几乎将R. albus产生的氢气利用完毕。然而,在低pH模型中,虽然MGC的生长延滞期较长,但它却在发酵过程中获得了绝大部分氢气,暗示MGC比M. smithii更耐受低pH。降低R. albus在发酵前期的氢气产生速度后,MGC获得了比M. smithii更多的氢气(67.8%),暗示MGC在低氢分压下具有较强的氢气竞争能力。为了进一步研究MGC的氢气竞争能力,本研究进行了下列实验。对氢气竞争模型进行连续传代,结果显示随着传代的进行总甲烷产量逐渐升高,然而M.smithii在模型中的菌体数量却在逐渐降低,这暗示MGC在竞争中占据了优势并压制了M. smithii的生长。将MGC接种到从瘤胃液中直接富集的混合细菌和甲烷菌培养物Mix中,发现MGC不但能够在Mix中存活,还能够大量繁殖菌体。结论：在低氢分压和甲基化合物充足的条件下,MGC具有较强的氢气竞争力。此外体外共培养模型为研究瘤胃甲烷菌提供了一条新途径。4RCC富集培养条件的研究本研究通过在体外共培养模型中添加甲基化合物富集瘤胃液中的RCc菌株。研究结果显示虽然在富集传代过程中产生了大量的甲烷,但培养液中的RCC不但没有富集反而大幅度降低。化合物Lumazine的添加并没有抑制甲烷短杆菌的生长,甲烷短杆菌的数量在培养液中始终维持在较高水平。将富集的产甲烷培养物接种到BJ培养基(无二氧化碳和碳酸氢钠)中,由于没有底物二氧化碳甲烷短杆菌的生长会受到抑制。结果显示用甲胺富集的培养物在BJ培养基中很快就没有甲烷产生,而用甲醇富集的培养物在BJ培养基中甲烷产量逐渐升高并趋于稳定。加入万古霉素处理后,镜检显示培养液中均是球形菌并有F420自发荧光。底物利用实验显示这些球形菌仅利用氢气还原甲醇生成甲烷。挑取克隆测序发现这些球形菌均是甲烷球形菌。结论：仅在体外共培养模型中添加甲基化合物不能富集RCc菌株。5不同精粗比日粮对山羊瘤胃内RCC丰度的影响本研究利用荧光定量PCR研究了不同精粗比日粮对山羊瘤胃中RCc丰度的影响。研究发现不同精粗比日粮对山羊瘤胃内容物、瘤胃粘膜、盲肠内容物和盲肠粘膜中的总古菌数量没有显著影响(P>0.05)。饲喂高精日粮的山羊瘤胃内容物和盲肠内容物中RCC数量显著低于高粗日粮组(P<0.05)。饲喂高粗日粮山羊的瘤胃内容物中RCC数量占总古菌数量的8.1-28.3%,而高精日粮组为0.6-4.6%。不同精粗比日粮对山羊瘤胃粘膜和盲肠粘膜中的RCC数量没有显著影响(P>0.05),这两部位中的RCC数量占总古菌数量的比例分别为3.4-4.3%和12.0-13.2%。结论：高精日粮显著降低山羊瘤胃内容物中RCC数量。