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目的：柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type3，CVB3)是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体。VP1是CVB3主要的衣壳蛋白，具有较强的免疫原性，可刺激机体产生保护性的中和抗体，但已有的国内外研究表明，编码VP1的DNA疫苗免疫小鼠后虽可诱导机体产生中和抗体，但效价较低，不能有效阻止致死量CVB3感染。因此如何增强VP1基因的免疫原性，提高免疫保护作用是目前亟待解决的问题，也是我室近几年的研究重点。国内外许多研究表明，联合应用细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA免疫效应，发挥佐剂作用。
目前发现，粒一巨噬细胞集落刺激因(GM-CSF)能激活单核巨噬细胞和中性粒细胞，有较强的免疫增强剂的作用，尤其是诱导树突状细胞成熟和功能性分布的作用已受到广泛注意，由于它可以通过促进包括树突状细胞(DCs)在内的抗原递呈细胞(APC)的增殖分化，将其吸引到注射部位，增强抗原提呈能力，从而达到增强免疫效果的作用，所以有可能被应用于免疫治疗中诱导抗原提呈细胞。鉴于GM-CSF有明显增强免疫和免疫调节作用，本研究构建了GM-CSF真核表达质粒。又因我室曾成功构建过pcDNA3/VP1-hIL-2和pcDNA3/mIFN-γ重组质粒，结果表明二者均在一定程度上增强了CVB3 VP1 DNA疫苗的免疫保护作用。故选用了对体液和细胞免疫应答均有上调作用的IL-2和同样能对多种细胞产生上调和诱导MHC I类及II类分子作用的IFN-γ的表达质粒作比较。将这三种质粒分别与pcDNA3/MDC-VP1融合基因DNA疫苗联合应用共同免疫小鼠，通过免疫小鼠后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用来观察接种后的免疫效果并比较它们对疫苗的免疫增强作用。方法：(1)利用pORF9-mGMCSFv26质粒，用自行设计的mGM-CSF特异性引物进行PCR扩增；(2)将扩增产物与pGEM-T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴定和测序；(3)取双酶切的mGM-CSF片段与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核表达重组质粒pcDNA3/mGM-CSF；(4)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提质粒取pcDNA3/mGM-CSF、pcDNA3/mlFN-γ、pcDNA3/hIL-2、pcDNA3/MDC-VP1 和pcDNA3，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化；(5)动物实验：将4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为9组，每组10只；9组分别为生理盐水对照组、空质粒对照组(pcDNA3组)、pcDNA3/MDC-VP1对照组、pcDNA3/hIL-2对照组、pcDNA3/mlFN-γ对照组、pcDNA3/mGM-CSF对照组及pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/hIL-2混合注射组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mIFN-γ混合注射组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mGM-CSF混合注射组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种100μg，每3周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第20天，眼眶静脉取血，分离血清，用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中和抗体。第3次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)杀伤活性的检测；另每组7只小鼠用致死量的CVB3(5LD50)进行腹腔注射，观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天。结果：(1)用自行设计的mGM-CSF特异性引物经PCR扩增出了mGM-CSF基因片段，基因片段的长度与预期值相符。(2)成功构建原核克隆载体pGEM-T/mGM-CSF，DNA测序证实目的基因序列与Genbank登录序列相同。(3)基因片段插入pcDNA3后酶切结果证实成功构建了pcDNA3/mGM-CSF。 (4)每次接种后，各组血清中和抗体的平均效价分别为：pcDNA3/MDC-VP1组1:5.79，1:10.71，1:19.22；pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组1:5.97，1:10.62，1:18.30；pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mIFN-γ组1:7.22，1:12.38，1:20.03；pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组1:6.50，1:12.73，1:24.50；其余组各次平均效价均低于1:5。单因素方差分析表明，三次免疫后以上四组中和抗体滴度逐次增加(P＜0.05)；第三次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的中和抗体滴度最高(P＜0.05)，其他各组间无差异。(5)小鼠脾淋巴细胞增殖试验分别以CVB3和刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)体外刺激淋巴细胞，检测细胞增殖活性。以上四组经单因素方差分析表明，以CVB3刺激时，pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组最强(P＜0.05)，其余组比较，pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组的增殖活性较其他组强(p＜0.05)，其余两组无差异；以ConA刺激时，仍是pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组最强(p＜0.05)，其它组无差异。(6)小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明，以上四组中pcDNA3/MDC-VP1组杀伤活性最低(p＜0.05)，其它组间差别无统计学意义。(7)用5LD50攻击小鼠，各组平均生存天数分别为：pcDNA3组7.9天，pcDNA3/MDC-VP1组10.6天，pcDNA3/hIL-2组9.4天，pcDNA3/mIFN-γ组8.9天，pcDNA3/mGM-CSF组9.1天，pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组10.3天，pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mIFN-γ组 8.7 天，pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组8.6天，生理盐水组10天。结论：(1)从pORF9-mGMCSFv26质粒中，扩增出了mGM-CSFcDNA。(2)成功的构建了小鼠GM-CSF基因重组真核表达质粒pcDNA3/mGM-CSF。(3)用致死量CVB3攻击小鼠后，三种佐剂并未使小鼠生存率提高。(4) 小鼠血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高，三次免疫后GM-CSF能显著提高pcDNA3/MDC-VP1融合DNA疫苗所诱导的中和抗体水平，其它两种细胞因子无明显作用。(5)GM-CSF与hIL-2均能增强小鼠特异性淋巴细胞增殖活性，并且GM-CSF作用更强；对于非特异性增殖反应，只有GM-CSF起到增强作用。(6)三种细胞因子均能增强基因免疫诱导的特异性CTL杀伤活性。(7)通过中和抗体滴度，特异性淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤率的实验，说明三种细胞因子对pcDNA3/MDC-VP1融合疫苗的免疫保护作用有不同程度的提高，并且GM-CSF的增强作用最显著。