论文部分内容阅读
背景冠心病是由遗传和环境多种因素导致冠状动脉粥样硬化(AS)而引起的疾病,由于遗传学上属于复杂疾病故多用关联研究冠心病易感基因,通常选择与冠心病异常脂质代谢功能相关的启动子区和基因编码区内的单核苷酸多态性SNP作为候选基因。HDL是抗AS的保护性因子,其主要的机制是介导的胆固醇逆向转运(RCT),ABCA1是迄今为止研究最多的、重要的促进胆固醇流出的细胞表面蛋白,SR-BI在巨噬细胞也介导细胞内胆固醇流出。ABCA1基因-565C/T和R219K两位点显示与冠心病发病显著相关,前者系上游启动子区-565位点胞嘧啶C被胸腺嘧啶T取代,后者系ABCA1第7外显子1051位置鸟嘌呤G被腺嘌呤A取代,导致219位氨基酸残基的精氨酸转变成赖氨酸。国外研究提示-565C/T的TT基因型及T等位基因与冠心病发病可能相关,R219K的AA基因及A等位基因型在欧美人群显示保护作用,降低冠心病发生风险,而在日本人中未发现与冠心病的关联。上述两位点与冠心病及中间表型HDL水平关联分析结论不一。SR-BI基因1外显子多态性是其cDNA4位点G→A的突变导致氨基酸由甘氨酸→丝氨酸变异,关联分析显示与冠心病和HDL相关。目前国内尚无大规模的有关胆固醇逆转运相关因子基因多态性与冠心病发病的临床关联研究,本论文着重对冠心病患者ABCA1和SR-BI基因进行研究,初步探讨基因多态性与脂代谢异常及冠心病发病的相关性,阐明其分子生物学机制。目的1.研究分析冠心病患者的传统危险因素、脂类代谢情况、冠状动脉病变特点;2.研究冠心病患者中ABCA1 gene promoter-565C/T和7exon R219K以及SR-BI1exon基因多态位点的遗传学分析;3.比较不同基因型冠心病患者外周血原代单核细胞来源的巨噬细胞ABCA1的表达及ABCA1介导的细胞内胆固醇外流功能,探讨冠心病患者巨噬细胞内胆固醇沉积的分子生物学机制。方法1.基因遗传学研究1.1本研究收集2007年1月至2008年4月在北京协和医院心内科及阜外心血管病医院心内科经冠脉造影确诊的冠心病患者516例,对照组为同期协和医院体检无冠心病、糖尿病和血脂异常的正常人544例。收集血糖血脂等传统危险因素及冠状动脉病变资料,所有研究对象均为汉族。1.2在基因水平,主要采用先进的高灵敏度连接酶检测反应法(LDR)测序,以检测片断长度多态性(RFLP)和直接测序(DS)为辅助方法对所有研究对象ABCA1 promoter-565C/T、7exon R219K及SR-BI 1exon三位点突变情况进行遗传学分析。1.3进行各种基因多态性与临床资料进行相关性分析。2 ABCA1介导的细胞内胆固醇外流的研究2.1在mRNA水平,采用实时荧光定量反转录PCR方法研究ac-LDL诱导单核细胞巨噬泡沫化后对ABCA1-565C/T不同基因型表达水平的影响。2.2在蛋白水平,采用Western Blot和ELISA方法测定ac-LDL诱导单核细胞来源的巨噬细胞泡沫化后ABCA1和SR-BI蛋白表达的变化。2.3在细胞水平,人外周血单核细胞原代培养及诱导巨噬泡沫化,并用~3H放射性同位素标记胆固醇,研究不同基因型患者的巨噬细胞来源泡沫细胞ABCA1介导的胆固醇外流。3统计方法:计算等位基因频率,做H-W平衡,构建单体型,所有分析应用SPSS13.0及专业遗传学软件。结果1.ABCA1和SR-BI基因遗传学研究:1.1冠心病组与对照组比较:年龄62±11岁,无显著差异,男性占74%多于对照组,总胆固醇4.46±1.03mmol/L;LDL 2.58±0.85 mmol/L;TG 1.86±1.54mmol/L明显升高;HDL 1.58±0.53 mmol/L;and ApoA 1.25±0.22g/L明显降低P均＜0.05;1.2 ABCA1-565 TT基因型及T等位基因频率在冠心病及对照组无显著差异(0.1627 Vs 0.1625;0.404 Vs 0.414,P＞0.05);1.3 ABCA1 R219K AA基因型+GA基因型频率CAD合并糖尿病组低于正常对照组(0.65 vs 0.73,P=0.079);1.4冠心病组与对照组相比ABCA1的-56C/T与R219K两位点构成单倍型频率无显著差异;1.5包括传统危险因素、-565C/T、R219K两基因位点以及两基因位点交互作用在内的的Logistic回归分析显示,R219K位点AA基因型与冠心病发病显著相关(OR=0.428,95%CI 0.227-0.306,P=0.009),系保护性作用。上述两基因位点无交互作用;1.6冠心病组心梗患者中ABCA1-565TT基因型比例较高,P=0.09,且在前壁心梗和多部位心梗患者TT基因型比例较高,P=0.007;1.7冠心病组ABCA1-565各基因型及R219K各基因型的HDL水平无显著差异P＞0.05。1.8在本研究汉族人群中,SR-BI 1exon基因突变率极低0.23%。2.体外细胞学培养实验:2.1单核细胞原代培养分化成巨噬细胞,经ac-LDL诱导成泡沫细胞;2.2本研究显示荧光定量RT-PCR在巨噬细胞的mRNA检测中是一个敏感的测定方法。2.3 ABCA1-565 TT型巨噬泡沫细胞胆固醇流出率低于C/T型和CC型:2.4 Real-time RT-PCR结果显示TT基因型巨噬细胞在无诱导和诱导后ABCA1mRNA表达较其他基因型显著增强,P＜0.05;TT型诱导后ABCA1mRNA表达自身比较下降有显著差异,P=0.001。2.5 TT型巨噬细胞中ABCA1蛋白表达显著低于C/T型和CC型,TT型诱导后ABCA1mRNA表达自身比较仅呈现下降趋势,P=0.059;结论1在中国汉族人群中,ABCA1promoter-565 T等位基因突变与CAD无显著相关;但冠心病患者人群内部分析结果提示TT型冠心病病情严重。2 ABCA1 7exon R219K AA基因型和A等位基因系冠心病发病保护性因子。3 SR-BI Gly4Ser在人群突变率极低;4 ABCA1-565C/T位点TT基因型ABCA1的蛋白表达及胆固醇外流功能较CC、CT型减低,推测是TT基因型通过影响巨噬细胞RCT功能而促进冠心病发生发展。创新、局限及展望:本研究选择多个位点联合分析,应用先进的高灵敏度LDR测序法及Real-time RT-PCR、Western-Blot基因分子生物学技术,以及国际通用~3H同位素标记的胆固醇外流测量法,对ABCA1启动子区和编码区2个常见位点进行分析,应用冠脉造影诊断冠心病有助于确诊及量化。局限性:一、关联研究本身的限制,选择偏倚和不能校正的混杂因素以及关联研究重复较难;二、冠心病发病还受许多其它机制的影响,本研究不可能一一涉及;三、后半部分功能研究受时间限制未能进一步进行质粒转染及蛋白组学研究,临床部分需继续扩大样本量。