研究背景：　　乳腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，是女性健康面临的主要问题。在新增的癌症患者中，每十例就有一例是乳腺癌女性患者，仅次于肺癌的发病率，占全国女性恶性肿瘤死亡率的第二位。乳腺癌可以转移至肺部和骨头，多年的临床研究证实，化疗仍是治疗乳腺癌不可或缺的治疗手段。但这些药物的作用有限，而且容易使细胞产生耐药性，并对人体正常细胞产生很大的毒副作用。因此，寻找高效、低毒的化疗或治疗药物成为当今抗肿瘤研究的重点和热点。　　天然产物是来源于丰富的自然资源的具有生物活性的天然功能性成分。目前，地球有超过25000多种的植物品种，每年约有400个新的天然产物从这些自然资源中产生。大量的报道表明，天然产物主要作用于重要的靶蛋白，通过引起肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞达到抗肿瘤的目的，阻止肿瘤的进一步发展。天然产物这种对肿瘤细胞选择性高和毒性低、成本低的特性使它能很好的作为化疗药物使用。　　狗舌草是菊科狗舌草属植物狗舌草Tephroseris kirilowii (Turcz.) Holub.的全草。狗舌草味苦、微甘，性寒，具有清热、解毒、活血消肿等功效。狗舌草还具有抗白血病作用，《唐本草》和《浙江民间常用草药》中记载的多个治疗白血病的配方如“三舌汤”和“复方 403”中均含有狗舌草。在现有的关于狗舌草活性成分的报道中，大都是关于生物碱类成分和总黄类酮活性筛选的研究, 没有对狗舌草的活性成分进行系统的分离和研究，未见有关于狗舌草中黄酮类单体化合物和其它活性成分的研究报道，而且也未见有关于狗舌草治疗乳腺癌的相关机制研究。　　目的：　　本研究主要以狗舌草(T. kirilowii)为研究对象，以MDA-MB-231乳腺癌细胞系为研究模型，拟通过现代色谱法对狗舌草进行系统的研究，从中分离出具有抗乳腺癌细胞作用的活性成分，并且探讨这些活性成分抗乳腺癌细胞的作用机制，以期能获得高效低毒的抗肿瘤活性药物或前体药物，并为进一步的深入研究肿瘤治疗的分子机制提供理论依据。　　方法：　　1. 运用现代色谱技术，对狗舌草的有效成分进行活性追踪的提取分离，包括D101大孔树脂柱层析，正相硅胶色谱柱层析、MCI树脂柱层析、ODS柱层析，sephadex LH-20凝胶柱层析，以及MPLC及HPLC技术　　2.用现代光谱学技术对分离所得的单体化合物进行了结构鉴定，这其中包括熔点测试、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、HSQC、COSY、NOESY等技术。　　3.采用MTT法检测了狗舌草中8个黄酮类化合物isorhamnetin (IH)、isorhamnetin-3- glucoside (IMG)、kaempferol (KpI)、apigenin (API)、acacetin (Aca)、chrysin (Chy)、7,8-dihydroxyflavanone (7,8-DHF)、genkwanin (GN)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的影响。　　4.采用MTT法，对比研究了IH、GN、Aca三种黄酮类化合物对多种不同种类的肿瘤细胞株（包括乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF7、肝癌细胞SMMC-7721、肺癌A549细胞、食管癌细胞Eca109）增殖活性的影响,以及对正常细胞的影响 (人乳腺细胞MCF-10A, 人脑胶质细胞HEB)。　　5.首先利用采用流式细胞分析技术和Western Blot方法，研究检测了IH、GN、Aca 这三个黄酮类活性化合物梯度浓度对 MDA-MB-231 细胞的周期及周期相关蛋白表达的影响。再采用western blot技术对调控G2/M期的关键蛋白进行了测试，以确定受试化合物是否对这些关键蛋白有一定的调控作用。　　6.采用流式细胞术和western blot方法检测了IH、GN、Aca三个黄酮类化合物对MDA-MB-231细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。　　7.采用激光共聚焦显微技术和Western Blot方法检测IH、GN、Aca三个黄酮类化合物对细胞自噬的影响。　　8.采用计算机辅助设计技术预测IH、GN、Aca三个黄酮类化合物诱导细胞凋亡的作用靶点，并在细胞及分子水平对预测结果进行验证。　　结果：　　1. 从狗舌草中共分离得到 34 个化合物，并运用现代光谱技术确定了所有化合物的结构: 二萜类1个，黄酮类化合物9个，五环三萜类7个，木脂素类4个，生物碱类3个，苯丙素类2个，香豆素类1个，甾类3个，链烃类4个。具体结构命名分别为：17-O-β-D-glucopyranosyl-(16α)-16,17,18-trihydroxyphyllocladan-3-one (TK1) Isorha mnetin (TK2)，Isorhamnetin 3-β-D-glucoside (TK3), Kaempferol (TK4), Apigenin (T K5), Acacetin (TK6), Genkwanin (TK7), Chrysin (TK8), Quercetin (TK9), 7, 8-Dihy droxyflavanone (TK10), Ethyl caffeate (TK11), p-Coumaric acid ethyl ester (TK12), (+)-Pinoresinol (TK13), (+)-Epipinoresinol (TK14), Salicifoliol (TK15), (-)-Syringaresi nol (TK16), Neoechinulin A (TK17), Aurantiamide acetate (TK18), Aurantiamide (T K19), Scopoletin (TK20), Arnidiol (TK21), Calenduladiol (TK22), Coflodiol (TK23), Maniladiol (TK24), Faradiol (TK25), Tormentic acid (TK26), Euscaphic acid (TK27),β-Stigmasterol (TK28),β-Sitosterol (TK29),β-Sitostenone (TK30), trans-Phytol (TK3 1), n-Hexadecanoic acid (TK32), Glycerol monolinoleate (TK33), Balansenate II (TK 34)。其中二萜类化合物TK1是首次分离得到的新化合物，有29个化合物为首次在狗舌草中分离得到。　　2.八个黄酮类化合物中有三个（IH、GN和Aca）对多种肿瘤细胞的增殖活性具有一定的抑制作用，但对正常的人乳腺细胞MCF-10A和人脑胶质细胞HEB的增殖活性没有影响。　　3. IH、GN、Aca三个黄酮类化合物对MDA-MB-231细胞具有明显的G2/M期阻滞作用。　　4. IH、GN、Aca三个黄酮类化合物可以显著地诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡，抑癌因子p53的表达水平明显升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL的表达水平明显下降。　　5. IH、GN、Aca三个黄酮类化合物可以诱导MDA-MB-231细胞产生自噬。　　6.计算机辅助设计预测结果表明，IH、GN、Aca三个黄酮类化合物可以和PI3Kγ蛋白激酶上的氨基酸残基结合产生相互作用，进一步的研究发现 IH、GN、Aca 三个黄酮类化合物可以通过下调 PI3Kγ 的表达，抑制 PI3Kγ 催化活性，进而抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K/ULK1信号通路，从而发挥其阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡及诱导细胞自噬产生的作用。　　结论：　　我们首次在狗舌草中(T. kirilowii)分离得到了34个化合物，其中包括一个新化合物(二萜类TK1)。而从狗舌草中分离得到的IH、GN和Aca三个黄酮类化合物具有抑制乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖及诱导细胞自噬的作用。其机制为这三个黄酮类化合 物 均 可 下 调 PI3Kγ 的 表 达 、 抑 制 PI3Kγ 催 化 活 性 ， 进 而 抑 制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K/ULK1信号通路，最终导致细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡及自噬的发生。