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金柑(Fortunella),芸香科金柑属植物。金柑作为带皮鲜食柑橘类水果,果实含有丰富的类黄酮。类黄酮不仅与植物的生长发育、植物生长素的运输、植物花色的形成、植物育性以及植物抗性等相关,而且具有抗氧化、消炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、防治心血管疾病、抗肿瘤以及抗癌等功效。植物类黄酮通过苯丙烷途径进行生物合成,是次生代谢研究的热点,类黄酮生物合成相关基因已在苹果、甜橙、草莓以及藤茶等植物中进行了研究,但在金柑中还未见报道。MYB转录因子基因家族、查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因以及查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因被大量报道与类黄酮生物合成紧密相关,且具有挖掘潜力。本试验以金柑果实为试验材料,探究MYB转录因子调节基因、查尔酮合成酶和查尔酮异构酶结构基因在类黄酮生物合成中的作用,以期为阐明金柑类黄酮合成分子机理提供基础信息。首先,从金柑果实中克隆7个MYB转录因子调节基因(FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6、FmMYB7)、3个CHS结构基因(FmCHS1、FmCHS2、FmCHS3)和4个CHI结构基因(FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3、FmCHI4),进行生物信息学分析。然后,以乙醇为溶剂,采用超声波辅助提取法提取不同发育阶段金柑果实总类黄酮,并用紫外分光光度法进行含量检测。最后通过实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)对不同发育阶段金柑果实中FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6、FmMYB7、FmCHS1、FmCHS2、FmCHS3、FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3以及FmCHI4基因的表达水平进行定量分析,探讨金柑果实发育过程中基因表达与类黄酮积累的相关性,解析基因的表达模式。主要研究结果如下:1、在金柑果实发育过程中,类黄酮含量随果实的膨大成熟逐渐降低,在果皮中呈明显的下降趋势,在果肉中呈先升后降的变化趋势。2、FmMYB1、FmMYB2、FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6与FmMYB7基因全长分别为789、1114、1384、2789、2752、938与2703bp,编码263、371、461、929、917、312与900个氨基酸,预测氨基酸编码蛋白质的相对分子质量与等电点分别为33.95、34.17、37.01、111.37、58.93、32.95、60.22kD与9.20、8.93、5.99、5.29、8.83、8.46、5.10。FmMYB2、FmMYB3与FmMYB6基因紧密聚为一类,FmMYB4与FmMYB7基因聚为一类,FmMYB1基因单独聚类,均界定为2R-MYB类转录因子,在DNA结合过程中发挥作用,与类黄酮合成相关;FmMYB5基因单独聚类,界定为3R-MYB类转录因子,对类黄酮积累进行多向调控。实时荧光定量结果表明,在金柑果实发育过程中,FmMYB1表达量呈下降趋势,在果皮中稳定高表达,在果肉中下降;FmMYB2表达量呈先降后升的变化趋势,在果皮中先升后降,在果肉中下降;FmMYB3表达量呈上升趋势,在果皮中先升后降,在果肉中上升;FmMYB4表达量呈上升趋势,在果皮果肉中均先降后升;FmMYB5表达量呈小幅度上升趋势,在果皮果肉中均先降后升;FmMYB6表达量呈上升趋势,在果皮果肉中均上升;FmMYB7表达量呈上升趋势,在果皮果肉中均先降后升。3、FmCHS1、FmCHS2与FmCHS3基因全长分别为821、651与1109bp,编码273、217与369个氨基酸,预测氨基酸编码蛋白质的相对分子质量与等电点分别为42.59、42.80、42.37kD与6.47、5.71、6.05。FmCHS1和FmCHS3与已知功能CHS聚为一类,界定为CHS蛋白;FmCHS2单独聚类,界定为CHS-like蛋白。实时荧光定量结果表明,在金柑果实发育过程中,FmCHS1表达量呈下降趋势,在果皮果肉中均下降;FmCHS2表达量呈先升后降的变化趋势,在果皮中高表达,在果肉中低表达;FmCHS3呈波动表达,在果皮果肉中均先降后升。4、FmCHI1、FmCHI2、FmCHI3与FmCHI4基因全长分别为759、1343、2422与898bp,编码253、447、807与299个氨基酸,预测氨基酸编码蛋白质的相对分子质量与等电点分别为23.23、23.98、45.93、31.06kD与5.01、5.04、8.43、8.96。FmCHI2、FmCHI3与FmCHI4界定为TYPE-I CHI蛋白,具有酶催化活性,参与类黄酮合成;FmCHI1界定为TYPE-IV CHI蛋白,与TYPE-I CHI蛋白互作,促进类黄酮合成。实时荧光定量结果表明,在金柑果实发育过程中,FmCHI1表达量呈下降趋势,在果皮中高表达,在果肉中低表达;FmCHI2表达量呈下降趋势,在果皮中下降,在果肉中先升后降;FmCHI3表达量呈先下降后上升再下降的多重变化趋势,在果皮果肉中均下降;FmCHI4呈波动表达,在果皮果肉中均先降后升。5、FmMYB1、FmMYB2、FmCHS1与FmCHI2在金柑果实发育过程中呈高表达模式,与类黄酮积累模式最接近,可能直接参与了类黄酮的生物合成;FmMYB3、FmMYB4、FmMYB5、FmMYB6与FmMYB7对类黄酮合成具有负向调控作用,其中FmMYB3与FmMYB6调控模式相近,FmMYB4、FmMYB5与FmMYB7调控模式相近;FmCHS2可能与果皮部位类黄酮的合成相关;FmCHS3、FmCHI4对果实膨大期与成熟期类黄酮合成部分路径进行调控;FmCHI1无催化功能,但与FmCHI2互作促进类黄酮合成;FmCHI3在类黄酮形成过程中产生间断性的影响。