欧李交替氧化酶基因(AOX2)的克隆及功能初步研究

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干旱胁迫是最常见的自然灾害,能导致作物大量减产、土地荒漠化等一系列问题。培育新型耐旱植物是解决这些问题的有效途径。欧李(Cerasus humilis (Bge.) Sok)具有非常强的耐旱性,同时具有很高的经济价值,这使得欧李成为旱地种植的热门树种。干旱胁迫下,植物通过ABA介导信号转导调控基因表达,来应对不良环境,其中,交替氧化酶(AOX)发挥重要作用。为了探究胁迫与欧李间的关系,我们分析了干旱和水杨酸处理后AOX和UCP两家族的表达情况。然后,运用分子生物学的方法成功构建了两原核表达载体和两植物表达载体。主要结果如下:1、干旱胁迫下,AOX家族和UCP家族成员的表达量整体上调,只有AOX1a和AOX2的变化不明显,其中AOX2的表达量在整个处理过程中都处于最高水平;相反,水杨酸处理后,两家族成员的表达普遍下调,仅UCP2例外,AOX2的表达量仍然处于最高水平。故推测AOX2基因是欧李响应胁迫的关键基因。2、欧李AOX2基因全长1559bp,5’端非编码区共185bp, 3’端非编码区共345bp,开放阅读框1029bp,编码342个氨基酸。欧李AOX2蛋白由多个α螺旋和多个无规卷曲相互交替构成,包含两个跨膜结构域,保守区域多集中在C端,与拟南芥的AOX2蛋白的同源性为66.96%,高出22个物种的平均水平1.98%。3、pGEX-4T-3-A在BL21(DE3) 、DH5a中不稳定表达,而在Rosetta(DE3)菌株中稳定表达,可溶性融合蛋白的量远远小于沉淀中的融合蛋白。最佳诱导条件为:IPTG浓度0.2mmol/L、15℃、180rpm诱导30h。经纯化得到了单一特异性蛋白条带,经Western blot鉴定为GST-AOX2。成功将欧李AOX2基因转入拟南芥中,并获得了可遗传的转基因拟南芥的T2代植株。
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