动脉压力感受性反射(arterial baroreflex,ABR)可以缓冲血压的升高和降低,是心血管活动最重要的调节机制之一。ABR功能可以被量化,用压力感受性反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)表示。BRS被认为是自主神经系统的标志。多中心临床试验结果表明,无论有无心血管疾病,BRS都是高血压、脑卒中、心律失常、心力衰竭及心肌梗死等疾病死亡率的强预测因子。当前常用去窦弓神经术破坏ABR传入神经(窦神经和主动脉神经)作为ABR功能缺陷的动物模型。以该动物模型为基础,在ABR功能和心血管疾病的关系及ABR功能低下导致高血压终末器官损伤等发面取得了一定的研究进展。但是该模型的缺点是非自发性,不能真正地模拟ABR功能缺陷的原因,与临床实际相差较大,并不是理想的动物模型。ABR缺陷的具体原因及分子机制现在还不明确,这也导致反射功能低下的基础研究进展缓慢。缺乏自发性ABR缺陷的动物模型是这一问题的限制因素。我们推测培育成功的自发性ABR缺陷动物,也会在许多心血管疾病方面表现出高风险性。基于这一模型,可以进一步明确ABR缺陷的中枢分子靶标。我们利用55只雄性和61只雌性SD大鼠筛选ABR功能正常和低下的大鼠。清醒自由活动状态下BRS和血压的测量结果显示,雄性大鼠的平均BRS和收缩压(systolic blood pressure,SBP)分别为0.77 ms/mm Hg和130 mm Hg。雌雄之间没有差异。根据BRS的分布,我们将BRS<0.6 ms/mm Hg的大鼠定义为动脉压力感受性反射功能缺陷的大鼠(arterial baroreflex-deficient rats,ABR-DRs),将BRS>0.8ms/mm Hg的大鼠定义为动脉压力感受性反射功能正常的大鼠(arterial baroreflex-normal rats,ABR-NRs)。由于高血压会影响BRS和交感活化,在培育过程中我们只选择血压正常的大鼠进行培育和繁殖。根据上述标准,我们选择了20只(♂:♀=1:1)BRS低的大鼠作为ABR-DRs的原代,20只(♂:♀=1:1)BRS高的大鼠作为ABR-NRs的原代。每一株大鼠原代,均采取随机配对的方法进行交配,得到第一代ABR-DRs,及其对照ABR-NRs。随后代数的大鼠采取“先近亲繁殖后筛选”的方式进行培育,即先兄妹近亲繁殖,待幼鼠离乳后,再对其父本进行清醒动物血压和BRS的测量。只有两个指标均符合上述筛选的标准,其子代才予以保留;否则,子代被淘汰。我们只筛选鉴定雄性动物,以减轻工作负担。经过20代的选择性培育,两株动物BRS差异显著(ABR-NRs vs ABR-DRs,1.20±0.26 ms/mm Hg vs 0.46±0.12 ms/mm Hg,P<0.01)。在培育过程中,尽管所有高血压大鼠的子代均已被淘汰,ABR-DRs的血压依然高于ABR-NRs。从第9代起,ABR-DRs的SBP和DBP比ABR-NRs均高约10 mm Hg。除了个别代数,两株大鼠的心率(heart rate,HR)并不存在差异。同时,我们对第19、20代的雌性大鼠也进行了血压和BRS的测量,发现雌雄间各个指标趋势相同。因此,在随后的研究中,我们只选用雄性大鼠。我们在不同年龄段(1、2、4、6、8月龄)测量了两株模型动物的BRS,以检查年龄是否影响两株大鼠间的差异。结果发现,从1月龄起,ABR-DRs的BRS就显著低于ABR-NRs(0.25±0.08 ms/mm Hg vs 0.72±0.25 ms/mm Hg,n=7,P<0.01)。随着月龄的增加,两株大鼠的BRS总体均呈增加趋势。到8月龄时,ABR-NRs的BRS高达1.19 ms/mm Hg,ABR-DRs则只增加到0.45 ms/mm Hg(P<0.01)。在接下来的研究中,我们开始验证我们的工作假设:心血管疾病的风险性随着BRS的分离而明显不同。我们通过股动、静脉插管的方法动态监测了不同月龄(1、2、4、6、8月龄)两株大鼠的SBP、DBP和心率。结果发现,在1月龄时,ABR-DRs的SBP和DBP就都显著高于ABR-NRs约10 mm Hg,心率显著快于ABR-NRs;随着月龄的增加,两株大鼠的血压持续性缓慢增加,差异依然存在,但心率不再有差异。我们也用尾动脉测压的方法动态监测了不同月龄时的上述指标,得到了相似的结果。更为重要的是,ABR-DRs的高血压发生率显著高于ABR-NRs。在第10代时,ABR-NRs的高血压发生率为10.7%(n=28),而ABR-DRs则为38.9%(n=36,P<0.05)。在第19代,差异更为显著(ABR-NRs,0%,n=28;ABR-DRs,57.8%,n=38;P<0.01)。这些结果表明ABR-DRs的高血压风险性增加。在2月龄时,我们检测了两株模型大鼠血清中血糖、血脂、肝肾功能相关代谢指标,发现ABR-DRs的随机血糖、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和瘦素均显著高于ABR-NRs,表明ABR-DRs出现了血糖、血脂代谢异常。而空腹胰岛素及肝肾功能相关指标没有差异。我们还检测了8月龄大鼠的糖代谢相关指标。与ABR-NRs相比,ABR-DRs的随机血糖、空腹血糖和糖化血红蛋白显著升高。但是,二者的空腹胰岛素水平并没有显著的差异。同时,ABR-DRs的糖耐量和胰岛素耐量受损,但胰岛素的分泌没有问题,很可能是机体对胰岛素产生了抵抗。因此,ABR-DRs存在代谢异常。我们观察记录了第20代ABR-NRs和ABR-DRs在1-25月龄期间的体重和进食量。在1月龄和2月龄时,ABR-DRs的进食量显著高于ABR-NRs,但二者体重没有差异。随后在3-8月龄(6月龄除外)期间,两株大鼠的进食量相同;从9月龄开始,ABR-DRs的进食量显著低于ABR-NRs。从7月龄开始,ABR-DRs的体重持续显著高于ABR-NRs。这两个指标的差异一直持续到24月龄。在10月龄时,我们对两株大鼠进行了脂肪分布的测量。与ABR-NRs相比,ABR-DRs的体重增加了96 g,总脂肪重量增加约45 g,其皮下、附睾、肠系膜、肾周及腹膜后、肩胛骨、胃周和主动脉周围的脂肪重量和比例均显著增加。这些结果表明,ABR-DRs存在超重问题。与ABR-NRs相比,ABR-DRs在舒张期和收缩期的左心室内径、左心室体积及射血体积、射血分数、心输出量均没有显著性差异,表明其并不存在心功能受损;但它们在舒张期和收缩期的左心室前壁厚度、收缩期的左心室后壁厚度显著增加,这表明ABR-DRs存在心肌肥厚。通过称重,我们发现,与ABR-NRs相比,ABR-DRs的心脏、左心室和右心室的重量显著增加,进一步说明其存在心肌肥厚;ABR-DRs单位厘米的主动脉重量也显著增加;二者右肾的重量并没有统计学差异。2月龄大鼠的急性心肌缺血结果显示,ABR-DRs左心室缺血组织重量和面积增加,说明其缺血损伤加重。在阻断大脑中动脉造成缺血性脑卒中模型中,ABR-DRs的缺血面积和比例显著增加,神经缺陷评分也明显增加。这些结果表明ABR-DRs急性心肌梗死和脑缺血的损伤加重。1-16月龄时的负重强迫游泳结果显示,ABR-DRs在各个时间点的游泳时间均短于ABR-NRs;并且随着年龄的增加,两株大鼠的游泳时间逐渐降低。跑台实验的结果也显示ABR-DRs跑步至力竭的时间显著短于ABR-NRs。这些结果说明,ABR-DRs的有氧运动能力低下。我们也记录了ABR-NRs和ABR-DRs的生存时间,结果发现,ABR-DRs的寿命显著缩短。以该动物模型为基础,我们展开了ABR功能缺陷的机制研究。我们通过记录肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity,RSNA)来检测ABR-DRs的交感神经是否存在过度活化。基础状态下,ABR-DRs的RSNA与ABR-NRs并没有统计学差异。然后,我们通过静脉给予一定量的去氧肾上腺素来升高血压(约50 mm Hg),激活压力反射,以观察ABR对交感神经活化的调控。结果表明,ABR-DRs的RSNA变化率与ABR-NRs相比并没有统计学差异。这些结果表明ABR-DRs压力反射的交感支并没有异常。与ABR-NRs相比,升压后ABR-DRs的心率降低幅度显著减小。而心率主要是由迷走神经系统调控的,因此上述结果表明ABR-DRs的副交感功能受损。迷走神经的中枢是疑核。疑核节前心迷走神经元(cardiac vagal preganglionic neurons,CVPNs)决定了心脏的紧张性和反射性调控,其自发性电活动的强弱与疑核副交感功能密切相关。我们利用逆向荧光染料(XRITC,Invitrogen)标记CVPNs,然后进行电生理膜片钳实验。与ABR-NRs相比,ABR-DRs疑核CVPNs的自发性放电频率频率显著降低。加入外源性谷氨酸,可兴奋CVPNs,增加自发性放电的频率,但ABR-DRs增加的百分比显著降低。这些数据表明,ABR-DRs的疑核CVPNs的电活动异常。谷氨酸能和γ-氨基丁酸能突触传递通路是疑核CVPNs的主要突触传入。我们同时阻断NMDA(N-methyl-D-aspartic acid,N-甲基-D-天冬氨酸)受体、AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)受体和GABAA(γ-aminobutyric acid,γ-氨基丁酸)受体,ABR-NRs和ABR-DRs CVPNs自发性放电的差异被取消。但是单独阻断GABAA受体并不影响两组大鼠CVPNs自发性放电之间的差异。因此,ABR-DRs疑核CVPNs的自发性放电频率降低主要是由谷氨酸能突触通路影响的。AMPA受体阻断剂预处理可以取消两株模型大鼠CVPNs自发性放电频率的差异,并且完全取消了谷氨酸对CVPNs的兴奋作用。NMDA阻断剂并不能取消两株大鼠间的放电差异,也不影响谷氨酸对CVPNs的兴奋作用,并且ABR-DRs放电频率增加的百分比依然显著低于ABR-NRs。因此,AMPA受体参与了ABR-DRs疑核CVPNs的电活动异常。本课题的实验结果表明,心血管疾病的危险因素确实随着BRS的分离而明显不同。ABR-DRs在许多心血管疾病方面表现出高风险性,如高血压、高血糖、高血脂、超重及有氧运动能力低下。BRS受损导致迷走神经传出减弱,是心血管疾病的危险因素,也会显著缩短生存时间。疑核心迷走神经元自发性放电频率降低,对谷氨酸反应减弱,AMPA受体很可能参与了ABR功能受损。