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枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特有的第一大干果树种,在植物分类上属鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物。酸枣是枣的野生型,是极具价值的药用植物资源。枣和酸枣种质资源丰富,研究枣和酸枣的遗传多样性及其亲缘关系,对阐明枣树起源和种质资源保护具有重要意义。针对这一科学问题,已开展了很多基于核基因组的分子标记研究,但是从细胞质遗传的角度,如利用叶绿体微卫星标记(ChloroplastSSR, cpSSR)技术,关于枣的单倍型组成、遗传多样性和地理起源研究还未见报导。所以,本论文利用cpSSR标记研究枣和酸枣的遗传结构及多样性,取得结果如下:(1)采用高盐-低pH法和改良高盐-低pH法比较研究了枣叶绿体分离和叶绿体DNA(Chloroplast DNA,cpDNA)提取。结果发现,高盐-低pH法提取的cpDNA,其OD260nm/OD280nm值均为1.28,质量低,不能满足测序要求;改良高盐-低pH法所得cpDNA产量明显提高,且cpDNA结构完整、质量高、纯度好,其OD260nm/OD280nm值介于1.8~2.0,无降解现象,可以满足测序要求。(2)根据本课题组已获得的枣树全基因组测序数据,利用Blast程序将获得的reads数据与已测的葡萄(Vitis vinifera)叶绿体基因组数据进行比对,抽取叶绿体基因组的数据。利用SOAP软件进行拼接、组装,最后用PCR补洞,得到一条长度为151,963bp的scaffold序列。基因注释表明,枣树叶绿体基因组由四个区域组成,包括大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)和两个反向重复区(IRA和IRB),共包含134个基因。(3)根据所得叶绿体基因组序列的特征,分别针对基因区和基因间隔区随机设计15对、28对特异引物,进行PCR扩增、测序,根据测序结果验证组装精确度。结果表明,基因区的组装准确度平均达到98%以上,而基因间隔区组装准确度平均92%。(4)根据测序验证结果,选择扩增产物长度、目标产物长度或扩增产物长度、测序产物长度一致或相似的cpSSR引物作为候选多态性引物。选取不同地区的枣品种11个和酸枣类型4个,用初选的cpSSR特异引物进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性检测,共获得9个具有多态性的标记位点。(5)选择72个枣品种、23个酸枣类型和1个毛叶枣(Z. mauritiana Lam.),用添加特异荧光标记的上游正向引物的6个多态性cpSSR标记进行PCR扩增,扩增产物经ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳分析。电泳结果用Gene Mapper软件进行数据收集和手工修正后,转为指纹数据矩阵后,发现6个标记在96个样品共检测到20个等位基因位点,平均有效等位基因数(Ne)为1.065~1.769,多样性信息指数(I)为0.159~0.1747,多样性指数(h)和无偏多样性指数(uh)分别为0.061~0.435和0.062~0.439。计算枣和酸枣两个群体的多样性指数后发现,酸枣多样性指数(Ne=1.619,I=0.483,h=0.303)相对高于栽培枣(Ne=1.393,I=0.437,h=0.256)。酸枣和枣群体的总体多样性为Ne=1.506,I=0.460, h=0.280,两个群体的Nei氏遗传一致性为0.970。AMOVA分析显示,群体内遗传变异(95%)大于群体间变异(5%)。(6)将获得的指纹数据转换为0/1矩阵后导入NTSYS软件并进行聚类分析。聚类结果显示,96个样品由7个叶绿体单倍型组成。其中,毛叶枣单独成为一个分支,酸枣和枣具有共同的单倍型类型ct1和ct4,单倍型ct2和ct3为枣特有,单倍型ct5和ct6为酸枣特有。由以上结果可知,枣和酸枣共同拥有多个单倍型,两个群体间没有发生显著的遗传分化,说明枣核酸枣的基因相互交流广泛,揭示出枣和酸枣亲缘关系紧密,也证明了酸枣到枣的进化是多条路线的。