论文部分内容阅读
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起仔猪腹泻的重要病原体,给当今养猪业造成巨大的经济损失。防控猪流行性腹泻通常使用疫苗、血清以及一些综合性措施,但单用疫苗显然效果不稳定,目前还不能解决该病的防控问题。本论文另辟蹊径,从营养调控着手,通过分离鉴定能够抑制猪流行性腹泻病毒黏附的乳杆菌菌株,用于防治猪流行性腹泻专用复合菌制剂的研制。使用选择性MRS培养基从仔猪粪便中分离细菌后,运用常规形态学观察、生化试验、16SrDNA序列分析、细菌-细胞-病毒共培养、SDS-PAGE分析、Real-time PCR等技术,以猪小肠上皮细胞(空肠)系(IPEC-J2)为体外细胞模型,筛选能够耐受肠道环境、黏附能力强并能抑制PEDV的乳杆菌,并提取乳杆菌S层蛋白探索其在抑制PEDV中的作用。试验一、仔猪肠道中乳杆菌菌株的分离鉴定本试验使用选择性MRS培养基从20份断奶仔猪新鲜粪便样品中分离得到80个细菌进行纯培养,经初步筛选得到革兰氏染色为阳性、触酶阴性的细菌28株。通过16S rDNA序列分析鉴定,这28株细菌中包括10株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreutei)、17株能动乳杆菌(Lacgobacillus)和1株屎肠球菌(Enterococcus faecium)。对菌落和菌体形态等特征的观察,可将这28个菌株分为6类,系统发育树的比较结果将这28个菌株分为4个群。结合上述结果从这28株细菌中挑选出7株具有不同特征且生长性能良好的菌株作为后续的试验菌株,分别为J3(E.faecium)、J14(L.reuteri)、J16(L.agilis)、J19(L.agilis)、J21(L.reuteri)、J23(L和 agilis)J26(L.reuteri)。试验二、黏附能力及对肠道环境耐受能力强的乳杆菌菌株的筛选本试验对7株筛选得到的候选菌株进行耐酸、耐胆盐和黏附性能试验。结果显示这7株菌,其耐酸、耐胆盐能力存在差异,在一定范围内的pH值(1.5、2.0和2.5)条件下处理2h后,3个菌株具有良好耐酸性,耐酸性由大到小分别为J26>J16>J21,J26在pH 2.5条件下存活率高达91.4%。J3和J26具有良好耐胆盐能力,0.3%的胆盐环境中处理2 h后存活率分别为26.1%和20.7%。总量为108CFU/mL的乳杆菌与IPEC-J2细胞混合培养2h后,黏附到细胞上的益生菌数量在104～106CFU/mL,其中的黏附能力最强的菌株为J26,达到1.72%。试验三、乳杆菌及其S层蛋白抑制PEDV黏附效果的研究本试验测定7株候选菌株及其S层蛋白抑制PEDV的能力。根据SDS-PAGE分析,提取的S层蛋白分子量为50 kDa左右,浓度为642.4μg/mL。从菌体、去除S层蛋白菌体及S层蛋白三个方面测定抑制PEDV感染细胞的能力,每种成份采用3种不同的作用方式,组1预防组(先加入菌液孵育,再加入病毒孵育);组2修复组(先加入病毒,再加入菌液孵育);组3竞争组(将菌液与病毒混合加入孵育)。待病毒对照组出现细胞病变时用MTT检测细胞活力。结果表明,菌体、去除S层蛋白菌体及S层蛋白均对病毒有抑制作用,总体上菌体的病毒抑制率最高,其次是去除S层蛋白菌体,S层蛋也有一定作用;不同菌株对PEDV感染细胞的抑制作用存在差异,不同的作用方式对病毒的抑制率影响也很大,抑制效果预防组>竞争组>修复组;去除S蛋白后病毒抑制率下降,可见S层蛋白在益生菌抑制PEDV黏附的过程中发挥了 一定的作用,并且S层蛋白抑制病毒的能力与浓度大小有关。使用Real-time PCR检测病毒在细胞内的增殖情况也得到了与上述试验相符的结果。综上所述,益生菌对病毒的抑制是菌体多种成份共同作用的结果,其中S层蛋白起到重要的作用。综合各项试验结果本研究最终选出J26菌株,经鉴定为罗伊氏乳杆菌(Lactobbacillus reuteri),16S序列见GenBank号KY863554。此菌株不仅具有很强的耐酸耐胆盐能力,而且对小肠上皮细胞黏附能力强并能够抑制猪流行性腹泻病毒对细胞的黏附,可作为猪用防治猪流行性腹泻专用微生态制剂的候选菌株,给猪用防治猪流行性腹泻专用微生态制剂的研制打下基础。