人胚胎干细胞是从人囊胚中分离内细胞团取得的具有自我更新能力的细胞系。人胚胎干细胞在体内、体外都具有分化为人体各种细胞的潜力。它具有与人类早期胚胎细胞相同的许多特性,可作为研究环境中化学物质对胚胎影响的细胞模型。由于伦理上的限制,对于人着床后胚胎发育的研究难以开展,因此人胚胎干细胞具有研究人胚胎早期发育的独特优势。　　 早期胚胎对环境的改变尤其敏感,暴露于高浓度的内分泌干扰物中对早期胚胎是很不利的。超促排卵在人类辅助生育技术中,对于改变妊娠率是很重要的。但是,因为多个卵泡同时发育,母体雌激素水平显著高于正常,即使在取卵后,胚胎种植窗时期,超生理状态的雌激素会持续整个黄体期,特别是在OHSS患者。而此时期胚胎正处于早期发育的重要时期。雌激素是一种内分泌干扰物,其可直接或间接通过相关细胞转导通路调控细胞增殖、分化,在关键基因的编程和印记中有重要作用。在体内雌激素对胚胎的发育着床是十分重要的,但是过高浓度的雌激素可能会影响胚胎的发育。我们将hESCs作为人类早期胚胎发育的细胞模型,用于研究超促排卵中引起的黄体期高雌激素水平对早期胚胎发育的影响。　　 在本研究中,我们检测了四个不同浓度的雌激素水平1×10-10M,1×10-9M.1×10-8M,1×10-7M对胚胎干细胞细胞周期的影响。检测了HDAC1的表达、组蛋白修饰、p21的表达探讨雌激素作用机制。　　 第一部分:胚胎干细胞雌激素受体的研究　　 目的：　　 本研究的目的是检测实验所用细胞处理方法未改变人胚胎干细胞的干细胞特性。研究所用的人胚胎干细胞系具有雌激素受体α,β的表达,且不同的浓度的17β-雌二醇对影响人胚胎干细胞雌激素受体量α,β的表达。　　 方法：　　 1.人包皮成纤维细胞(HFF)培养:1)HFF原代培养:以1×106/ml接种于培养皿,在37℃、含5％CO2孵箱中培养,每5天更换培养液。2)HFF的传代、冻存及复苏:按1:4的比例传代。按(3～6)×106/mL入液氮中保存。37℃解冻后,复苏细胞按1×106/mL接种于培养皿。3)HFF丝裂霉素C处理2h,冷冻于液氮备用。4)丝裂霉素C处理后,2-2.5×10-4/ml,接种到培养皿中,过夜备用。2.hESCs培养:1)hESCs接种:接种ES细胞于HFF饲养层或人源基质胶铺皿,5％CO2、37℃,1-1.5天换液一次。2)传代、冻存及复苏:机械法按照1:3-1:5传代。玻璃化冷冻及解冻:用筛网入液氮中。　　 3.干细胞的鉴定:免疫荧光技术检测OCT-4.阳性表达、SSEA-4阳性表达、SSEA-3阳性、TRA-1-60阳性、TRA-1-81、SSEA-1阴性、CD-90阴性、CD-9阴性。核型检测正常46XX。体内分化.畸胎瘤的形成。　　 4.实验细胞处理:无饲养层的条件下传三代,无血清培养基培养24小时,17β-雌二醇无血清培养基培养24小时。不含17β-雌二醇无血清培养基组做为空白对照。细胞检测SSEA-4阳性表达,收集细胞备用。　　 5.RT-PCR:Trizol提取细胞总RNA,反转录,SYBR Green qPCR检测mRNA水平。　　 6.Western-blot印迹分析:提取细胞总蛋白,测定蛋白质含量,SDS-PAGE凝胶电泳,蛋白质的电转移,蛋白印记。计算OD值,检测蛋白水平。　　 结果：　　 1.我们应用RT-PCR和Western-blot检测了雌激素受体α,β的表达。我们发现雌激素受体α,β在人胚胎干细胞中有表达。　　 2.17β-雌二醇可诱导雌激素受体α,β的表达。生理水平的17β-雌二醇(1×10-9M)可促进雌激素受体α,β的表达,而随着17β-雌二醇浓度的增加,雌激素受体α,β的表达量反而逐步降低。雌激素受体β表达量的变化比雌激素受体α明显。与1×10-9M相比,雌激素受体β蛋白水平在雌激素浓度为1×10-7M时下降。　　 第二部分:17β-雌二醇对人胚胎干细胞细胞周期的影响　　 目的：　　 本研究应用流式细胞仪检测不同浓度的17β-雌二醇对人胚胎干细胞细胞周期的影响,检测HDAC1,组蛋白修饰,p21探讨雌激素的作用机制。　　 方法：　　 1.人包皮成纤维细胞(HFF)培养:1)HFF原代培养:以1×106/ml接种于培养皿,在37℃、含5％CO2孵箱中培养,每5天更换培养液。2)HFF的传代、冻存及复苏:按1:4的比例传代。按(3～6)×106/mL入液氮中保存。37℃解冻后,复苏细胞按1×106/ml_,接种于培养皿。3)HFF丝裂霉素C处理2h,冷冻于液氮备用。4)丝裂霉素C处理后,2-2.5×10-4/ml,接种到培养皿中,过夜备用。　　 2.hESCs培养:1)hESCs接种:接种ES细胞于HFF饲养层或人源基质胶铺皿,5％CO2、37℃,1-1.5天换液一次。2)传代、冻存及复苏:机械法按照1:3-1:5传代。玻璃化冷冻及解冻:用筛网入液氮中。　　 3.干细胞的鉴定:免疫荧光技术检测OCT-4阳性表达、SSEA-4阳性表达、SSEA-3阳性、TRA-1-60阳性、TRA-1-81、SSEA-1阴性、CD-90阴性、CD-9阴性。核型检测正常。体内分化-畸胎瘤的形成。　　 4.实验细胞处理:无饲养层的条件下传三代,无血清培养基培养24小时,17β-雌二醇无血清培养基培养24小时。细胞检测SSEA-4阳性表达,收集细胞备用。　　 5.RT-PCR:Trizol提取细胞总RNA,反转录,SYBR Green qPCR检测mRNA水平。　　 6.Western-blot印迹分析:提取细胞总蛋白,测定蛋白质含量,SDS-PAGE凝胶电泳,蛋白质的电转移,蛋白印记。计算OD值,检测蛋白水平。　　 7.流式细胞仪检测细胞周期:胰酶打成单细胞,固定,-20℃过夜。细胞染色,上机计算12000个细胞,计算细胞各期的百分数。　　 结果：　　 1.流式细胞仪检测细胞周期　　 未经17β-雌二醇处理的细胞做对照,G1期的细胞在1×10-9M的雌二醇处理组减少,而S期的细胞增多。处于增殖期的细胞(G2+S)比例增加,p<0.05,有统计学意义。提示1×10-9M诱导细胞从G1期到增殖期细胞的转变。以1×10-9M组为对照:1×10-8M、1×10-7M G1期细胞比例增加p<0.05,有统计学意义。1×10-8M、1×10-7M G2+S期细胞比例降低,p<0.05,有统计学意义。　　 2.不同浓度17β-雌二醇调节HDAC1的表达　　 应用未处理的hESCs做对照,HDAC1在1×10-10M、1×10-9M表达升高,在1×10-9M达到最大。p<0.05,有统计学意义。以1×10-9M做对照组,HDAC1的mRNA的表达量在1×10-8M、1×10-7M下调。p<0.05,有统计学意义。蛋白印迹的结果与mRNA的结果基本相同,但是在1×10-10M时,HDAC1蛋白水平并没有mRNA的表达中所体现的一个明显的升高。　　 3.不同浓度17β-雌二醇诱导了hESCs不同的组蛋白修饰　　 H4K5ac的蛋白量在1×10-10M、1×10-9M下降,在1×10-7M升高。H3K9me2与phH3S10的变化趋势基本相同。在1×10-9M、1×10-8M、1×10-7M,H3K9me2的蛋白水平升高。在1×10-10M,H3K9me2的蛋白水平降低。在1×10-8M、1×10-9M,phH3S10的蛋白水平升高。17β-雌二醇在所有的浓度均增加了H2A.Z的表达。　　 4.不同浓度的17β-雌二醇对CDK抑制因子的表达的影响　　 在1×10-10M,p21mRNA表达量降至最低,1×10-7M时表达量达到最高,但结果并没有统计学意义。与1×10-9M相比,在1×10-8M、1×10-7M,17β-雌二醇增加了p21基因的表达。p<0.05,有统计学意义。　　 结论：　　 1.人胚胎干细胞中有雌激素受体α,β的表达。　　 2.17β-雌二醇可诱导雌激素受体α,β的表达,生理浓度的17β-雌二醇能最大程度的诱导雌激素受体α,β的表达。　　 3.17β-雌二醇在黄体期生理浓度促进人胚胎干细胞从G1期到增殖期细胞的转变,相比生理浓度,过高的雌激素浓度对人胚胎干细胞的增殖不利。　　 4.17β-雌二醇调节HDAC1的表达、组蛋白修饰、p21的表达且具与浓度有关。