大斑刚毛球腔菌（Setosphaeria turcica （Luttrell）Leonard﹠Suggs，俗称玉米大斑病菌）属子囊菌门毛座腔菌属，由其引起的玉米大斑病是一种严重威胁玉米生产的真菌病害，多发生于全球冷凉地域的玉米产区，常造成严重经济损失。研究表明，cAMP信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号跨膜转导途径，对植物病原真菌的形态发生及发育、次生代谢以及致病性等生物进程均起着非常重要的调控作用。本试验利用简并引物PCR法克隆了2个玉米大斑病菌cAMP磷酸二酯酶基因，其中包括1个高亲和力cAMP磷酸二酯酶基因（StH-PDE）和1个低亲和力cAMP磷酸二酯酶基因（StL-PDE）。分别创制StH-PDE和StL-PDE基因敲除突变体，对目的基因进行功能研究，主要研究结果如下：1.从玉米大斑病菌基因组中，获得了1个高亲和力cAMP磷酸二酯酶基因和1个低亲和力cAMP磷酸二酯酶基因，分别命名为StH-PDE和StL-PDE。其中，StH-PDE基因DNA全长3208bp，含有6个外显子和5个内含子，cDNA为2898bp，编码965个氨基酸，编码产物计算分子量约为107.16kD；StL-PDE基因DNA全长5054bp，含有5个外显子，4个内含子，cDNA为3089bp，编码1019个氨基酸。上述基因的内含子基本符合GT-AG法则。2. StH-PDE编码产物的氨基酸序列与多种病原真菌，如Aspergillus fumigatus、Botrytis cinerea、Metarhizium acridum、Neosartorya fischeri等的H-PDE氨基酸序列相似性在33.12%~36.60%之间，具有保守的Ⅰ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域、Ⅰ型cAMP磷酸二酯酶保守位点和依赖金属离子的磷酸水解酶保守“HD”基序（HD motif），但与StL-PDE的相似性仅为20.33%，说明两个基因属于不同的磷酸二酯酶类群。StL-PDE编码产物的氨基酸序列与Trichoderma reesei、 Beauveria bassiana、Colletotrichum higginsianum、Talaromyced stipitatus等病原真菌的L-PDE氨基酸序列相似性为21.98%~23.06%，其中含有L-PDE特有的Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域。3.检测了StH-PDE基因在玉米大斑病菌不同发育时期的表达规律，发现StH-PDE基因在菌丝时期的表达量最高，在孢子萌发时期以及附着胞形成时期次之，在分生孢子发育以及侵染丝形成时期表达量最低。4.利用质粒pUCATPH和pBS，根据基因同源重组原理，构建了StH-PDE基因敲除载体。将重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体，经潮霉素筛选获得了潮霉素抗性转化子，通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及StH-PDE基因特异性引物对转化子进行PCR筛选，得到了9株阳性转化子；对其中3株转化子进行单孢分离，并进行Southern blot及RT-PCR验证，最终获得2株StH-PDE基因缺失突变体菌株△StH-PDE2和△StH-PDE3。对△StH-PDE2和△StH-PDE3突变体进行了功能分析，发现2株突变体菌落颜色呈深黄色，气生菌丝减少，且生长速度较野生型菌株慢；菌丝细胞膨大，细胞分隔变短且表面出现不规则褶皱，细胞壁完整性降低，菌丝细胞外包裹红色分泌物；其次，突变体菌株具产孢缺陷，菌丝可在玻璃纸表面诱导形成附着胞，但附着胞形成过程明显延迟，且穿透玻璃纸的能力降低；再者，突变体菌株细胞内甘油含量升高，抗盐胁迫能力增强，疏水性下降，易出现可湿表型，胞内黑色素含量降低；漆酶及HT-毒素活性没有明显变化；此外，经组织病理学观察发现，突变体菌株能够正常侵入寄主组织，但侵染效能较野生型有所降低。RT-PCR分析表明，StH-PDE基因对细胞壁合成相关基因（CHS、GFA、FKS、GSC、GEL）、微管蛋白基因Tubulin、疏水性调控基因MPG1、水甘油通道蛋白基因FPS以及调控黑色素合成的转录因子基因SMR的表达均有重要的调控作用。6.检测了StL-PDE在玉米大斑病菌不同发育时期的表达规律，结果表明，StL-PDE基因在玉米大斑病菌菌丝时期的表达量最高，其次是在孢子萌发时期和附着胞形成时期。7.利用相同的基因敲除载体构建策略构建了StL-PDE基因敲除载体，经潮霉素抗性和PCR筛选获得了10个转化子。对其中的△StL-PDE1和△StL-PDE10突变菌株单孢分离，并经Southern blot及RT-PCR验证，明确其为StL-PDE缺失突变体。对△StL-PDE1和△StL-PDE10突变体菌株进行了表型分析，发现突变体气生菌丝较野生型茂密，且生长速度较野生型菌株略快；突变体菌丝出现多分枝现象，分生孢子产量降低，且细胞分隔处表面出现不规则突起，菌丝可在玻璃纸表面诱导产生附着胞，但其穿透玻璃纸的能力较野生型降低；其次，突变菌株细胞内甘油含量积累升高，抗盐胁迫能力增强；胞内黑色素含量减少；漆酶活性显著降低。RT-PCR分析表明，△StL-PDE1、△StL-PDE10突变体中细胞壁合成相关基因（CHS、GFA、FKS、GSC、GEL）、微管蛋白基因Tubulin、疏水性调控基因MPG1和野生型菌株没有明显差异；水甘油通道蛋白FPS表达量略有下调。由此得出结论：1）StH-PDE基因在调控玉米大斑病菌菌丝细胞形态建成以及细胞完整性、分生孢子发育、次生代谢、感知营养的能力、胞内黑色素生物合成、应答盐胁迫反应以及致病性等方面均具有重要调控作用；2）StL-PDE在调控玉米大斑病菌分生孢子发育、菌丝附着胞的侵染能力以及胞内漆酶活性等方面具有重要调控作用。3）StH-PDE基因在玉米大斑病菌生长发育过程中担负主要的调控作用，而StL-PDE基因则担负较为次要的调控作用。