细胞融合是目前工业微生物育种的重要手段,与转基因技术相比,细胞融合技术更安全、更高效,且已广泛应用于很多领域,如免疫学,生物学,遗传学等。芽孢形式抗逆性强,具有耐热、耐酸碱、耐干燥、抗紫外线和抗有机溶剂等特性,芽孢乳酸菌赋予了乳酸菌芽孢的特性,作为一种活菌制剂,可以更好的到达胃肠道体内定植,能够更好的发挥其生理功能,应用效果相对于死菌来说也更加良好。本研究以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)作为芽抱杆菌代表,以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)做为乳酸菌代表,进行原生质体融合,旨在获得能够生成芽孢的需氧的、更容易培养和制剂化的产芽孢乳酸菌,并建立快速的乳酸菌与芽孢杆菌融合子筛选方法,为产芽孢乳酸菌细胞融合育种工作提供快速简便的大批量筛选方法。本研究以产芽孢和产β片半乳糖苷酶为指标对融合子进行表型鉴定,筛选出4株阳性融合子,作为引物筛选的对照菌株。为了建立纳豆芽孢杆菌-嗜酸乳杆菌融合子鉴定的多重PCR方法,根据亲本菌株的特异性基因序列,设计引物,以亲本菌株DNA为模板,优化每对引物在适宜退火温度下的PCR反应体系。并且以不产芽孢菌株、产芽孢的其他菌株以及乳酸菌为对照菌株,对每对引物的特异性进行检测。然后对上述50个融合后的菌株进行单重PCR鉴定。以阳性融合子基因组DNA为模板,以亲本菌株和阴性融合子为对照菌株,进行多重PCR研究,筛选可用引物对并建立反应体系。结果表明,根据芽孢杆菌的芽孢形成早期因子基因spoOA设计的引物对P1/P2能特异性扩增出本研究所有受试芽孢杆菌的spo0A基因片段(308 bp),而7株乳酸菌全部呈阴性;根据13株乳酸茵β斤半乳糖苷酶基因的保守序列设计的引物对P3/P4可扩增出所有受试乳酸菌和经表型鉴定确定的阳性融合子中的目标基因片段(576bp),而对芽孢杆菌无扩增,说明所设计的引物具有特异性,且对50个菌株的单重PCR鉴定结果与表型鉴定一致。多重PCR结果表明,在P3/P4的最优体系中可实现308bp和576bp两个片段的共扩增,对50个菌株的鉴定结果与单重PCR和表型鉴定结果100%吻合,而在P1/P2的最优体系中融合子只有308 bp片段得以扩增,故选择P3/P4的最优体系作为多重PCR反应体系。P3/P4 最优体系中模板 DNA 1 ng/μL,每条引物 0.4 μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq酶0.06 U/μL;PCR时94 ℃预变性5 min;以后循环中94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸60s,产物末端72 延伸7min。与表型鉴定和单重PCR鉴定比较,所建立的多重PCR方法简便、快速、特异性好;由于所设计的引物经过特异性检测可适用于芽孢杆菌和乳酸菌,因而适用于所有芽孢杆菌与所有乳酸菌融合子的快速鉴定。