背景与目的膀胱癌是目前泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,也是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤,且呈逐年增高趋势。膀胱癌的发病原因较复杂,主要有遗传和环境两大因素。吸烟和长期接触化工药品是目前两大环境致病危险因素。其中,吸烟是最为肯定的危险致病因素。研究表明,吸烟可以使膀胱癌发病率增加2-4倍,且危险系数与吸烟强度及吸烟时间成正比。目前,膀胱癌根据浸润深度的不同,临床上多采用不同的治疗方案。浅表性膀胱癌多采用经尿道膀胱肿瘤电切术联合术后膀胱灌注治疗,但术后复发率较高,约60-70%,且复发后有恶性程度增加的趋势。而对于肌层浸润性膀胱癌,临床上目前的标准治疗方法是根治性全膀胱切除术。但是,此手术创伤较大,术后多并发症,且极大的影响患者生活治疗。因此,泌尿外科医生希望明确膀胱癌发生、发展的分子生物学过程,并以此找到能够有效早期诊断、治疗膀胱癌的新方法。MicroRNA是一类小分子非蛋白编码RNA(长度约22个碱基)。它们虽然不能直接编码合成蛋白,但可以通过与靶基因3’UTR部分或完全配对结合抑制其翻译,或造成其特异性降解,以此起到调控基因转录后表达的作用。我们根据前期基因芯片研究发现,miR-582在膀胱尿路上皮癌细胞中呈低表达,通过体外细胞实验,探索miR-582在人膀胱癌细胞中的作用,为膀胱癌的诊断和治疗提供新的靶点。材料、方法及结果第一章miR-582在人膀胱尿路上皮癌中的表达差异方法:1.收集根治性全膀胱切除术后,经病理确认为尿路上皮癌的新鲜肿瘤组织标本为肿瘤(阳性)组及对应的癌旁正常上皮组织,提取组织RNA。2.利用QPCR技术,检测膀胱癌组织及细胞中,miR-582的表达水平。结果:1.与正常癌旁组织相比,膀胱尿路上皮癌组织中,miR-582的表达水平明显下调。2.膀胱尿路上皮癌的组织及细胞中,miR-582呈现稳定低表达,且其表达量与肿瘤的病理分级、临床分期密切相关。第二章miR-582在膀胱癌致病中生物学功能研究方法:1.利用lipofectation 2000将miR-582 mimic瞬时转染进人膀胱癌24、5637细胞中,造成miR-582表达下调。设立对照组(转染miR-NC组)和实验组(转染 miR-582 mimic)。2.转染后的细胞,通过QPCR方法评估转染效率;通过划痕实验,评估膀胱癌细胞的迁移能力;通过Transwell实验,评估膀胱癌细胞的侵袭能力;通过流式细胞技术,评估膀胱癌细胞的干性能力;通过Western Blot实验,评估膀胱癌细胞表征细胞侵干性能力的CD44、S0X2蛋白表达情况。结果:1.转染miR-582mimic后,T24、5637细胞中miR-582的表达明显上调,差异存在统计学意义(P<0.05)。2.划痕实验中,转染20h后,miR-582 mimic组的伤口愈合时间明显延长,差异存在统计学意义(P<0.05);Transwell实验中,转染miR-582mimic组的T24、5637细胞穿膜细胞数远小于miR-NC mimic组处理细胞,差异存在统计学意义(P<0.05);通过流式细胞技术,证实miR-582 mimic组的膀胱癌T24、5637细胞,细胞干性明显下降。第三章miR-582靶向负调控FOXG1表达及FOXG1的作用和意义方法:1.利用miRNA靶基因在线预测软件,预测miR-582下游靶基因,并通过荧光酶素报告基因加以证实。2.在膀胱癌T24、5637细胞中共转染miR-582和过表达F0XG1质粒后进行拯救实验,利用Transwell实验检测膀胱癌细胞侵袭能力的变化,Western blot实验检测蛋白表达变化。3.利用si-FOXG1转染处理人膀胱癌T24、5637细胞株,通过Western blot方法评估转染效率;通过Transwell实验,评估膀胱癌细胞的侵袭能力。结果:1.miRNA靶基因在线预测软件与荧光素酶报告实验结果提示:miR-582在F0XG1基因的3’UTR存在miR-582的互补结合位点。2.转染miR-582于膀胱癌细胞后,膀胱癌细胞侵袭能力下降,而随着外源性F0XG1的加入,侵袭能力增强;MMP2、MMP9等蛋白也在miR-582的影响下表达下调,而随着外源性F0XG1的加入而表达增强。3.Transwell实验中,转染si-FOXG1组的T24、5637细胞穿膜细胞数远小于si-NC组处理细胞,差异存在统计学意义(P<0.05)。此结果提示,F0XG1表达下调能够有效抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。结论和意义miR-582在膀胱癌组织中表达下调,且其表达量与肿瘤的病理分级、临床分期密切相关,病理分级越高、临床分期越晚的病人,表达量越低。miR-582在膀胱癌细胞中,靶向负调控下游靶基因F0XG1,从而实现起抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭、细胞干性的功能,发挥抑癌基因的作用。本项研究,可以为膀胱癌的分子靶向治疗,提供实验依据。