目的痛觉和恐惧被认为是有机体对外来伤害的一种有利的保护性行为,它的产生和建立对行为和健康有着强烈的影响。然而,如果痛觉和恐惧在不适当的时候被激活或者持续时间过长则会对机体产生伤害。树鼩作为类灵长类哺乳动物,在解剖、生理、免疫及进化等各方面与人类高度相似,因此,建立树鼩恐惧记忆动物模型可为研究人类相关疾病提供更好的动物模型。材料与方法1.实验Ⅰ:探索树鼩在明暗箱中的活动规律该实验包含三个阶段:训练阶段、适应阶段和实验阶段。在训练阶段,所有的动物在无电刺激的情况下每天允许在明暗箱中自由活动30 min;在适应阶段,动物被允许进行环境及实验节奏的适应,共持续3d;在实验阶段,每只动物进行10 min的测试(每次测试记录前有3 min的适应时间以消除应激反应带来的误差)。实验阶段对动物的处理与适应阶段一致,同时进行动物行为的记录、处理与分析。分析记录的行为指标包括移动距离、平均移动速率、停留时间以及在两箱之间的穿梭次数。本次实验独立重复三次。2.实验Ⅱ:寻找电击树鼩足底合适的电压该实验两个隔室皆为明室(即都用LED提供照明)。这个实验由两个阶段组成:适应阶段和测试阶段。适应阶段与实验Ⅰ相应阶段一致。3 d适应性训练之后进行测试阶段的实验。在测试阶段,动物有10 min的测试时间,在这10 min内,随机选择一个隔室给予电刺激。电刺激的程序为:每隔30 s时间给10 s的电刺激,电压从0 V递增至20 V,增幅为4 V。本实验中在一个电压下将所有动物测试完后调至下一电压进行下一轮测试,寻找合适的电击电压。3.实验Ⅲ:树鼩条件恐惧记忆的建立该实验由4个阶段组成:适应阶段、刺激前阶段、恐惧记忆形成阶段、恐惧记忆维持阶段。适应阶段的处理和实验Ⅰ中相应阶段一致。在恐惧记忆形成阶段,动物在明箱中不给予电击,动物一进入暗箱中就给予合适足底脉冲电刺激,以建立恐惧记忆,并形成对黑暗的条件刺激。刺激电压由稳压电源提供,电脉冲由时间继电器控制。电脉冲刺激程序与实验Ⅱ中的电脉冲程序一致。所有动物进入实验装置时两箱均为明箱,在动物适应环境之后随机选择一个隔室关LED灯,随后进行记录。对照组不给电刺激,其他处理完全一致。所有动物每天只进行1次实验。4.实验Ⅳ:树鼩条件恐惧记忆的抹除在实验组动物形成条件恐惧7周后,启动记忆抹除实验。该实验包括3个阶段即原恐惧记忆维持阶段、新恐惧记忆建立阶段和原恐惧记忆抹除阶段。在新恐惧记忆建立阶段,动物一到明箱就受到足底电击刺激,刺激电压由稳压电源提供,电脉冲由时间继电器控制。电脉冲程序与实验Ⅲ中的电脉冲程序一致,连续刺激4 d。随后的观察阶段撤去电刺激。所有动物进入实验装置时两箱均为暗箱,在动物适应环境之后随机选择一个隔室开LED灯,随后进行记录。每只动物每天只进行1次实验。5.数据收集所有的实验均在14∶00~18∶00之间进行的。在测试阶段的10 min内,动物在每个隔间内的活动情况由摄像机记录,通过行为学分析软件Etho Vision XT 9(Noldus,Wageningen,the Netherlands)进行分析,统计出动物在每个隔间内的停留时间(Duration)、移动速率(Velocity)、移动距离(Distance)、在两隔室间的穿梭次数(Frequency)等数据进行统计分析。在处理视频过程中,如果动物处于两个隔室的之间,我们规定以动物的中心为参考点进行处理。6.数据统计分析所有的数据均采用SPSS 16.0统计软件进行分析,数据表示形式为均数±标准误(`x±s)表示,数据的计算及统计图表的生成由软件Graph Pad Prism 5.0完成。实验Ⅰ和实验Ⅱ中的数据采用配对t检验进行统计学分析,实验Ⅲ和Ⅳ中的数据采用重复测量方差分析统计学分析。P<0.05被认为有统计学意义。结果1.实验Ⅰ:探索树鼩在明暗箱中的活动规律在没有任何刺激情况下,让树鼩在明暗箱中自由活动。结果显示,树鼩在暗箱中停留时间为(476.773±26.965)s,而明箱中只有(117.075±31.176)s。两者相比有统计学意义(P<0.01)。树鼩在明暗两箱中的移动距离无统计学意义(P<0.01),在两箱中的移动速率有统计学意义(P<0.01)。其在两箱间的穿梭次数为(21.42±4.245)次。以上结果表明树鼩虽然是一种昼行性动物,但更喜欢停留在暗箱之中;明箱中停留时间少、移动距离大、平均速率高等特点与树鼩白天外出觅食习性相符,表明树鼩的活动规律并没有因为明暗箱而改变。2.实验Ⅱ:寻找电击树鼩足底合适的电压在两相同的明室中,仅在一室中给予不同电压足底电击,树鼩(n=6)表现出不同的活动特征。0、4、8 V电压下,树鼩在两个隔室中的停留时间、移动速率、移动距离、穿梭次数均无统计学意义(P>0.05)。当电压在12 V以上,树鼩在有电刺激的隔间停留时间开始有统计学意义(P<0.05)。移动速率和移动距离在16 V前均无统计学意义(P>0.05),20 V时移动速率有统计学意义(P<0.05)。穿梭次数在16V以上时有统计学意义(P<0.05)。由于20 V电压下树鼩的伤害较大,考虑到动物的福利保护和更强的刺激效果遂选用16V电压作为合适电压进行电击,并用于接下来的实验中。3.实验Ⅲ:树鼩条件恐惧记忆的形成动物随机分为实验组(n=4,暗箱中给予足底电刺激)和对照组(n=4,无电刺激)。结果显示,两组树鼩在电刺激前均喜欢在暗箱中活动,符合树鼩的喜暗习性。在电刺激后实验组树鼩在明箱中的停留时间、移动距离均增大(P<0.001),平均移动速率减少(P<0.001)。而暗箱中则相反,其在暗箱中的停留时间、移动距离均减少(P<0.001),平均移动速率增大(P<0.001)。树鼩在两箱间的穿梭次数减少(P<0.001)。以上结果表明树鼩对暗箱的恐惧记忆已经形成。4.实验Ⅳ:树鼩条件恐惧记忆的抹除在结束恐惧记忆维持阶段后,启动记忆抹除实验。结果显示,在明箱中给予电刺激之前,实验组树鼩对暗箱的恐惧并未消退。在电刺激之后实验组树鼩在明箱中的停留时间、移动距离均减少(P>0.05),平均移动速率增大(P>0.05)。而暗箱中则相反,其在暗箱中的停留时间、移动距离均增大(P>0.05),平均移动速率减少(P>0.05)。表明树鼩对明箱恐惧记忆已经形成。树鼩在两箱间的穿梭次数先增大后减少(P<0.05)表明树鼩对明箱恐惧记忆形成,对暗箱的恐惧记忆被抹除。。结论树鼩能够成功诱导条件恐惧记忆,并维持7周以上无消退迹象,与大鼠、小鼠作为条件性恐惧模型的自然衰减相比较更为稳定,同时树鼩的条件恐惧记忆在特定的环境下能够被选择性的抹除,对树鼩的研究将为人类相关疾病研究工作提供更好的实验动物模型。