论文部分内容阅读
研究背景和目的:视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞不断吞噬光感受器外节（photo receptor segment, POS）末端脱落的膜盘而形成脂褐素（lipofuscin, LPF）。脂褐素的大量沉积可造成RPE细胞结构及功能的改变,从而导致AMD、Stargard病等眼部疾病。钙离子是细胞一切生命活动重要的第二信使,但病理情况下大量的钙离子内流引发钙超载可造成细胞的损伤及凋亡。有研究表明,钙超载是一切细胞死亡的最后通路。盐酸氟桂利嗪（flunarizine, FNZ）是第四代高选择性的钙离子通道拮抗剂,可以阻滞过量的钙离子内流,从而稳定细胞膜,减少氧自由基的产生,保护细胞。盐酸甲氯酚酯（centrophenoxine, CPH）是一种临床使用多年的中枢神经系统兴奋剂,具有清除细胞内脂褐素及氧自由基、保护细胞膜等作用。本实验旨在观察培养人RPE细胞和牛POS共培养建立RPE细胞脂褐素形成的模型中,钙超载在RPE细胞脂褐素形成过程中的作用及FNZ、CPH对其的抑制作用及对RPE细胞活力的影响。方法:（1）将培养人RPE细胞与制备的2×1010 /L牛POS共培养,建立脂褐素形成模型。用钙荧光指示剂Fluo-3/AM、激光扫描共聚焦显微镜（laserscanning confocal microscope,LSCM）及流式细胞仪（flow cytometry, FCM）观察培养12 h,1、2、4和8 d时间点胞内钙离子的变化;用MTT比色法及嗜银蛋白染色分析法观察培养12 h,1、2、4和8 d的细胞活力。（2）用Fluo-3/AM、LSCM及FCM观察不同浓度盐酸氟桂利嗪对培养人RPE细胞和牛POS共培养脂褐素生成模型中12 h,1、2、4和8 d胞内钙离子变化的影响;用MTT比色法及嗜银蛋白染色分析法观察培养12 h,1、2、4和8 d的细胞活力。（3）用Fluo-3/AM、LSCM及FCM观察FNZ、CPH及FNZ和CPH联合作用对脂褐素形成模型中12 h,1、2、4和8 d胞内钙离子变化的影响;用MTT比色法及嗜银蛋白染色分析法观察培养12 h,1、2、4和8 d的细胞活力。结果:（1） LSCM结果:与POS培养的细胞内钙离子荧光强度在12 h达到高峰值777.33±63.86 U （P<0.01）,之后下降,但至8 d仍维持在较高值334.12±30.55 U （P<0.01）;对照组为165.36±29.92 U。细胞内脂褐素自发荧光平均强度在培养8 d达到350.24±26.49 U,而对照组为105.51±15.39 U （P<0.01）。FCM结果:对照组RPE胞内钙离子荧光值为11.1±0.36,共培养后在12 h达到最大值69.3±0.75 （P<0.01）,之后下降,但于8 d仍维持于42.3±0.44 （P<0.01）。脂褐素荧光值随培养时间延长而不断增高,在共培养8 d达到23.5±0.36,和对照组（3.6±0.24）相比较有显著性差异（P<0.01）。MTT法显示共培养细胞相对增殖率于1 d达到最大值84.4%,之后下降。AgNORs分析结果:和对照组相比,和牛POS共培养的实验组RPE细胞胞核内AgNORs颗粒数目增多,在2 d达到最高值4.2 （P<0.01）,后随时间的延长而减少,在8 d降到3.6。（2） LSCM及FCM结果:和对照组相比,各FNZ组对各时间点钙离子内流均有抑制作用（P<0.05）,脂褐素荧光值在4 d和8 d和对照组相比具有显著差异,但和浓度并不完全呈剂量相关性,25μmol/L FNZ组作用最强。MTT比色分析及AgNORs分析结果:不同浓度FNZ对于共培养引起的1 d细胞活力的显著增强具有抑制作用（P<0.05）,并随FNZ浓度加大,抑制作用增强。（3） LSCM及FCM结果: FNZ组及FNZ + CPH联用组钙离子荧光值对于共培养过程发生的钙超载具有一定程度的抑制作用（P<0.01）。FNZ和CPH联用组抑制作用最强。各组对于共培养后4 d 8 d脂褐素的形成均有一定抑制作用（P<0.05）。以FNZ和CPH联用组抑制作用最强,8 d为125.01±18.79,而对照组为350.24±26.49 （P<0.01）。MTT比色分析及AgNORs分析结果:各组对于共培养对照组1 d 2 d细胞活力的显著增强均具有一定抑制作用。和对照组相比,FNZ + CPH联用组抑制作用最强（P<0.01）,且作用后4 d8 d细胞活力仍保持上升趋势。结论:在培养人RPE细胞和牛POS共培养形成脂褐素过程中,钙离子大量内流,其变化可能在脂褐素产生及蓄积过程中起到重要的作用,并刺激细胞的增殖活力。盐酸氟桂利嗪和盐酸甲氯芬酯合用可以抑制RPE脂褐素形成过程中的钙超载及脂褐素形成,并保持细胞活力的持续增长。创新点:本实验探讨了钙超载在培养人RPE细胞和牛POS共培养形成脂褐素过程中的作用及FNZ、CPH对其抑制作用及对RPE细胞活力的影响。该研究在国内外尚未见报道。