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第一章黄芩素通过MD2减轻TBHP诱导的H9C2细胞损伤目的:探讨天然产物黄芩素减轻TBHP诱导的H9C2细胞损伤的机制,探寻黄芩素减轻TBHP诱导的H9C2细胞损伤的靶点,阐明MD2在TBHP诱导的H9C2细胞损伤过程中的作用。方法:体外培养大鼠心肌H9C2细胞,用流式细胞仪检测黄芩素对TBHP诱导的大鼠心肌H9C2细胞凋亡的影响,MTT实验检测黄芩素对H9C2细胞的毒性,流式细胞仪检测黄芩素预处理后TBHP诱导的H9C2细胞内ROS,WST法检测大鼠心肌H9C2细胞内SOD,应用MDA试剂盒检测心肌H9C2细胞内MDA,ELISA法检测TBHP诱导的H9C2细胞炎症因子水平,流式细胞仪和JC-1荧光染色法检测TBHP诱导的H9C2细胞线粒体膜电位变化,细胞免疫荧光法检测TBHP诱导的H9C2细胞细胞色素C释放和NF-κB核转移,western blot检测凋亡和内质网应激相关蛋白的表达。体外H9C2细胞,ELISA法检测LPS诱导的H9C2细胞炎症因子水平。采用表面等离子共振技术(SPR)实验检测了黄芩素是否能与MD2蛋白发生直接结合;采用计算机模拟分子对接技术观察黄芩素与MD2的结合位点和结合方式;bis-ANS荧光光谱实验检测黄芩素与MD2的亲和力;免疫共沉淀技术检测黄芩素对TBHP诱导的MD2/TLR4复合物的影响。体外培养H9C2细胞,通过Lipo 2000脂质体将MD2 Si RNA转染入H9C2细胞内,24 h后用Western Blot技术验证MD2沉默效果。ELISA法检测沉默MD2基因后TBHP刺激H9C2细胞后细胞培养基中的炎症因子水平。WST法检测沉默MD2基因后TBHP刺激H9C2细胞内的SOD。流式细胞仪分别检测沉默MD2、沉默TLR4和沉默MD2+TAK后TBHP刺激H9C2细胞内的ROS。流式细胞仪检测NRK-52E细胞MD2基因沉默及加入TAK后细胞内ROS。结果:黄芩素减轻TBHP诱导的H9C2细胞凋亡;黄芩素对H9C2细胞的IC50为134.7μM,毒性小;黄芩素减轻TBHP刺激H9C2细胞引起的氧化应激和炎症反应;黄芩素减少TBHP刺激H9C2细胞引起NF-κB P65核转移,保护TBHP刺激H9C2细胞引起的线粒体膜电位下降,减少TBHP刺激H9C2细胞引起的线粒体细胞色素C的释放,减少凋亡和内质网应激相关蛋白的表达。表面等离子共振技术(SPR)结果表明黄芩素能与MD2发生直接相互作用,计算机模拟分子对接技术发现黄芩素嵌入到MD2蛋白疏水性口袋中,并且与MD2口袋中的Tyr102形成氢键作用,bis-ANS荧光光谱分析发现随着黄芩素浓度的增加,bis-ANS与MD2蛋白结合的荧光强度逐渐下降;免疫共沉淀实验也表明黄芩素的加入能够降低LPS诱导的MD2/TLR4复合物的形成。沉默MD2后TBHP诱导的H9C2细胞炎症因子释放减少,细胞内ROS降低,SOD升高。MD2沉默和TLR4抑制剂协同减低TBHP诱导的H9C2细胞内ROS。沉默MD2减低TBHP诱导的NRK-52E细胞内ROS。结论:黄芩素通过降低NOX4的表达从而减轻TBHP刺激H9C2细胞引起的氧化应激;通过减少NF-κB P65的核转移减轻TBHP刺激H9C2细胞引起的氧化应激;黄芩素减轻TBHP诱导的H9C2细胞内质网应激和线粒体功能障碍。黄芩素的作用靶点是MD2蛋白;MD2基因沉默减轻TBHP刺激H9C2细胞引起的炎症和氧化应激。第二章黄芩素通过MD2减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤目的:动物层面验证黄芩素减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制,进一步阐明MD2在心肌缺血/再灌注损伤病理过程中的作用。方法:建立小鼠心肌缺血/再灌注模型。采用随机数字表法将40只正常C57BL/6小鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、模型组(I/R组)、黄芩素15 mg/kg+I/R组、黄芩素30 mg/kg+I/R组,每组10只。20只C57BL/6MD2-/-小鼠随机分为2组:假手术组(MD2-/-Sham组)、模型组(MD2-/-I/R组),每组10只。给药组(黄芩素15 mg/kg+I/R组、黄芩素30 mg/kg+I/R组)在造模前2 h经小鼠尾静脉注入对应浓度的黄芩素。假手术组暴露小鼠左冠状动脉前降支,但不结扎,模型组和给药组小鼠左冠状动脉前降支结扎30 min后松开结扎线恢复血流灌注4 h。处死小鼠,收集小鼠静脉血和心尖部心肌组织标本。用TTC/Evances blues双染色法测量并计算不同组别小鼠心肌梗死面积(IFN)、心肌缺血危险区域面积(AAR),计算IFN/AAR;用TUNEL试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况;利用肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测小鼠血清CK-MB和LDH水平;利用ELISA技术分别考察小鼠心肌组织中TNF-α、IL-6水平,检测小鼠心肌组织中SOD和MDA水平;应用免疫荧光技术考察小鼠心肌组织NF-κB p65亚单位入核情况;心肌组织匀浆离心后应用Western Blot技术分别考察不同组别小鼠心肌组织氧化还原代谢关键酶(NOX4),内质网应激信号通路上的关键酶(ATF4、ATF6、p-e IFα、CHOP)及凋亡信号通路相关蛋白(Bcl-2、BAX、cle-caspase 3、cle-caspase 9)的表达;应用免疫组化技术分别考察不同组别小鼠心肌组织NOX4、CHOP、cle-caspase 3蛋白表达。结果:黄芩素和MD2基因敲除减少小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的心肌梗死面积,减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的心肌凋亡,降低血清CK-MB和LDH水平,减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的炎症反应和氧化应激,减少小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的NOX4,CHOP,cle-caspase 3等蛋白表达和NF-κB P65亚单位的核转移。结论:黄芩素和MD2基因敲除通过降低NOX4的表达从而减少心肌缺血/再灌注后组织内氧自由基的生成,减轻氧化应激保护MIRI;通过减少NF-κB P65的核转移从而减少炎症因子的生成和释放,减轻炎症反应保护MIRI。