【摘 要】
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研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,它与肿瘤微环境的关系尚未研究全面。乳酸,有氧糖酵解的代谢产物,它贯穿于肿瘤发展的整个过程。结直肠癌产生的乳酸、分泌的转化生长因子β（TGF-β）与肿瘤微环境的炎症小体等物质形成复杂的网络,从而调控其发展过程。本课题通过研究结直肠癌来源的乳酸诱导THP-1来源巨噬细胞中炎症小体激活与抑制的机制,探讨乳
【基金项目】
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国家自然科学基金（12026605）；
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研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,它与肿瘤微环境的关系尚未研究全面。乳酸,有氧糖酵解的代谢产物,它贯穿于肿瘤发展的整个过程。结直肠癌产生的乳酸、分泌的转化生长因子β（TGF-β）与肿瘤微环境的炎症小体等物质形成复杂的网络,从而调控其发展过程。本课题通过研究结直肠癌来源的乳酸诱导THP-1来源巨噬细胞中炎症小体激活与抑制的机制,探讨乳酸使机体实现免疫监视的同时逃避免疫监视的机制。本研究将为临床研发新的结直肠癌靶向药物带来新的思路。研究方法1 THP-1细胞予佛波酯（PMA）诱导后,暴露于乳酸、细菌等炎症小体激活刺激物。2 结直肠癌来源的乳酸刺激THP-1衍生的巨噬细胞中炎症小体的激活（1）使用含/不含葡萄糖培养基培养结直肠癌细胞HCT116,收集上清刺激THP-1衍生巨噬细胞;（2）予乳酸、丙酮酸、丝氨酸刺激巨噬细胞,蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）检测 Caspase-1、IL-1β 的活化;（3）予乳酸、MSU处理稳转ASC-GFP的巨噬细胞,对ASC-GFP点定量分析;（4）NLRP3 siRNA转染巨噬细胞,予乳酸处理,WB检测Caspase-1、IL-1β的表达,RT-PCR检测NLRP3 mRNA水平;（5）用乳酸处理巨噬细胞,流式细胞仪检测ROS水平;予ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸NAC预处理巨噬细胞,再用乳酸处理,WB检测Caspase-1、IL-1β的表达。3 乳酸通过刺激TGF-β信号通路抑制THP-1衍生的巨噬细胞中炎症小体的激活（1）TGF-β预处理巨噬细胞,再用乳酸、经典配体刺激炎症小体活化,检测Caspase-1、IL-1β的表达;对ASC-GFP点定量分析;（2）TGF-β预处理后对细菌、MSU、ATP诱导炎症小体激活的影响,对ASC-GFP点定量分析;（3）TGF-β不同时间预处理对细菌诱导炎症小体激活的影响,予TGF-β Ⅰ型受体抑制剂SB431542干预,检测Caspase-1、IL-1β的活化;（4）SMAD2 siRNA转染THP-1衍生巨噬细胞,先予TGF-β预处理,再予乳酸处理,检测Caspase-1、IL-1β的活化;TGF-β对ASC-GFP聚集的作用。4 TGF-β通过SMAD-自噬-ROS信号转导途径抑制炎症小体激活（1）TGF-β预处理巨噬细胞,再进行乳酸处理,WB检测Caspase-1、LC3表达;流式细胞仪检测ROS水平;（2）用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预已予TGF-β、乳酸处理的巨噬细胞,WB 检测 Caspase-1、IL-1β 和 LC3 表达。结果1 乳酸可作为DAMP刺激THP-1衍生的巨噬细胞中炎症小体的活化,也可诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体活化。2 乳酸通过上调ROS来激活THP-1衍生的巨噬细胞炎症小体。3 乳酸通过刺激TGF-β来抑制THP-1衍生的巨噬细胞中炎症小体的激活。（1）乳酸可诱导结直肠癌细胞中TGF-β的表达和分泌;（2）TGF-β可抑制乳酸或经典配体诱导的炎症小体激活;（3）TGF-β通过TGF-β R1来抑制炎症小体的活化。4 TGF-β通过SMAD-自噬-ROS信号转导途径抑制炎症小体激活。（1）TGF-β处理减弱了乳酸诱导的ROS累积;（2）随着TGF-β处理时间延长,自噬越明显。结论结直肠癌细胞来源的乳酸可刺激THP-1衍生巨噬细胞中炎症小体的激活,也诱导结直肠癌细胞分泌TGF-β,而TGF-β通过SMAD-自噬-ROS通路抑制炎症小体的激活,从而逃避免疫监视。
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