皮肤恶性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是一种高度恶性的皮肤肿瘤,具有侵袭性强、易早期发生转移、致死率高等特点。黑素瘤的发展与转移是肿瘤细胞与肿瘤浸润微环境通过细胞因子等分子信号相互作用的结果,肿瘤浸润微环境中的关键分子对肿瘤的诊断和靶向治疗具有重要意义,成为肿瘤研究的热点之一。本课题组前期研究发现趋化因子CCL18在CMM组织中表达上调,并通过体外实验证实CCL18具有促进黑素瘤细胞侵袭转移的作用,是黑素瘤的潜在致病基因。本研究从RNAi方面开展皮肤黑素瘤CCL18表达调控机制的研究,明确miR-128及CCL18在黑素瘤组织中的表达及其关系,初步探索miR-128靶向CCL18调控黑素瘤细胞侵袭转移的作用,筛选出高效沉默CCL18的miRNA分子,为黑素瘤的治疗提供新的切入点。第一部分CCL18在皮肤黑素瘤组织、患者血清中的表达及意义本课题组前期通过全基因组表达芯片技术进行差异表达谱分析,发现CCL18基因在中国人肢端黑素瘤(acral lentiginous melanoma,ALM)患者的肿瘤组织中表达发生明显上调,并通过免疫组化方法初步验证CCL18在CMM中的表达高于色素痣,而且CCL18水平在Clark分级≥Ⅱ级的黑素瘤明显高于Clark分级Ⅰ级的黑素瘤。为探讨趋化因子CCL18表达与皮肤黑素瘤的发生发展过程的关系,我们通过real-time PCR、ELISA分析,发现CMM患者组织中CCL18 mRNA及血清中CCL18蛋白水平明显增高。此外我们扩大样本量通过免疫组化方法检测CCL18在58例CMM及50例色素痣中的表达,并分析CCL18表达水平与黑素瘤临床病理特征的关系。结果证实CCL18在CMM中表达增加,其表达水平与肿瘤Clark分级、Breslow厚度及VEGF表达呈正相关性,并且CCL18在肿瘤发生溃疡及淋巴结转移情况时表达水平较高。可见CCL18在CMM组织中呈异常高表达,并且其表达水平与CMM恶性程度密切相关。此外,免疫荧光实验证实皮肤恶性黑素瘤组织中肿瘤细胞胞质表达CCL18。第二部分靶向调控CCL18基因的miRNAs生物信息学预测及筛选通过生物信息学分析预测靶向调控CCL18的miRNAs,并应用荧光素酶报告基因检测法对预测的miRNAs与CCL18基因3’ UTR的相互作用进行验证。采用real-time PCR法检测14例CMM新鲜组织中CCL18和预测的miRNAs的表达,并分析相关性,其中miR-128在CMM中表达降低,而且与CCL18的表达具有显著负相关性。结果表明miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。第三部分靶向沉默CCL18基因的miR-128调控效应分析前文实验结果表明miR-128可能是靶向调控CCL18基因的miRNA分子,我们将miR-128作为研究对象。通过RNAi研究miR-128对CCL18表达的调控,以及miR-128调控CCL18对人黑素瘤细胞株A375生物学行为的影响及其可能机制。CCL18 在黑素瘤细胞株 A375、M14、MV3 和 SK-mel-28 中均不表达,IL-4(20ng/ml)刺激人外周血单核细胞可产生CCL18。因此我们采用单核细胞与A375细胞株共培养的方法模拟肿瘤浸润微环境,采用携带miR-128 mimics的腺病毒转染单核细胞,同时用阴性对照腺病毒设置对照。我们采用CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞技术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,Transwell小室实验检测细胞运动迁移能力,观察各组A375细胞的体外生物学行为改变;进一步通过Western blot方法检测细胞中E-cadherin,N-cadherin及β-catenin表达情况。结果表明,转染miR-128 mimics显著降低单核细胞CCL18的表达,能够有效促进人黑素瘤细胞株A375凋亡,抑制细胞跨膜迁移及克隆形成,但对细胞增殖无影响。黑素瘤细胞中间质型蛋白N-cadherin表达降低。miR-128沉默CCL18可能抑制上皮间质转化,影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。结论在恶性黑素瘤组织及患者血清中,趋化因子CCL18表达均明显上调,且高表达与黑素瘤的恶性程度相关。miR-128能够作用于CCL18基因的3’UTR发挥靶向沉默作用。体外细胞学实验表明miR-128靶向沉默CCL18表达可促进黑素瘤细胞A375调亡,明显降低其克隆形成及迁移运动能力,影响上皮间质转化,从而部分抑制CCL18的促癌作用。可见,趋化因子CCL18与恶性黑素瘤的发生发展密切相关,CCL18在促进黑素瘤的侵袭和转移过程中起到重要作用,miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。CCL18可能成为黑素瘤诊断和治疗中新的靶向目标。