阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常见的神经退行性疾病,其主要病理变化是细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和细胞外淀粉样老年斑(senile plaques, SP)。临床病理研究发现,AD患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的NFTs数量呈正相关,NFTs的主要蛋白成分为过度磷酸化的tau蛋白。Tau蛋白是神经细胞中的微管相关蛋白,其生理功能为促进微管组装和稳定微管结构,tau蛋白过度磷酸化过后失去上述生物学功能,并且自身聚合形成双螺旋丝和NFTs,导致神经元微管破坏、胞体-轴突营养物质运输及信息传递障碍和神经元退化死亡。引起tau蛋白异常过度磷酸化的机制是蛋白激酶活性升高和/或磷酸酯酶活性下降,研究显示cAMP-依赖性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)在tau蛋白异常过度磷酸化中起重要作用。Forskolin为PKA特异性激动剂,在体内激活PKA后,可以直接磷酸化tau从而产生过度磷酸化的tau蛋白,被PKA预磷酸化的tau蛋白更易被糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和周期蛋白依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5, CDK5)磷酸化。神经元重新进入细胞周期是AD主要的神经病理学特征之一。中枢神经元通常被认为处于终末分化状态,意味着它们不再进入细胞周期。然而,越来越多的研究显示AD患者脑中的神经元存在细胞周期的重新进入,重新进入细胞周期将导致神经元死亡。AD脑中含有NFTs的神经元存在细胞周期调控因子(cyclin B、PCNA和Cdc2等)的异常表达与激活,cyclin D1是调节神经元离开G0期进入G1期的关键分子,AD患者脑中其水平升高,表明AD脑中含有NFTs的神经元存在细胞周期的重新进入,提示了tau蛋白过度磷酸化与神经元重新进入细胞周期之间可能的内在联系。第一部分Forskolin诱导培养的原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化(一)目的探讨Forskolin诱导的原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化。(二)材料与方法本部分研究以培养的新生1天SD大鼠原代海马神经元为实验对象,使用4μmol/L cAMP-依赖性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)的特异性激动剂Forskolin分别处理原代海马神经元Oh、3h、6h、12h和24h,用免疫印迹和免疫荧光技术检测在上述不同时间点上tau蛋白Ser214、Ser396及Ser202/Thr205位点的磷酸化水平。用Image J图像分析软件对免疫印迹结果进行灰度分析,用SPSS13.0统计软件采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),用LSD法对组间数据进行多重比较。实验重复三次用于统计分析,即样本量为3。(三)结果新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48h,用4μmol/L Forskolin处理0h、3h、6h、12h和24h,进行免疫印迹和免疫荧光检测原代海马神经元tau蛋白的磷酸化水平,结果显示：tau蛋白Ser214位点的磷酸化在Forskolin作用6h和12h升高,其中6h时tau蛋白的磷酸化达到高峰(F=10.059,P<0.005),24h下降至0h水平；tau蛋白Ser396位点的磷酸化在Forskolin作用6h时升高(F=4.813,P<0.05),12h时达到高峰(F=4.813,P<0.005),24h时降至0h水平；tau蛋白Ser202/Thr205位点的磷酸化在Forskolin作用3h、6h、12h和24h时均升高,其中12h时tau蛋白的磷酸化达到高峰(F=2.720,P<0.005),24h时下降至3h水平；Forskolin作用0h、3h、6h、12h和24h的总tau蛋白水平之间没有差异(F=0.720, P>0.05); Ser214. Ser396和Ser202/Thr205位点磷酸化的tau和总tau均主要分布在胞质。(四)结论4μmol/L Forskolin诱导培养的原代海马神经元tau蛋白在Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化,其磷酸化高峰分别为Forskolin作用6h、12h和12h。第二部分Tau蛋白过度磷酸化的同时神经元重新进入细胞周期(一)目的探讨tau蛋白过度磷酸化与神经元重新进入细胞周期的关系。(二)材料与方法本部分研究以培养的新生1天SD大鼠原代海马神经元为实验对象,用4μmol/L cAMP-依赖性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)的特异性激动剂Forskolin处理原代海马神经元诱导tau蛋白过度磷酸化,采用免疫印迹法检测原代海马神经元细胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1,采用免疫荧光双标技术检测原代海马神经元Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位。用Image J图像分析软件对免疫印迹结果进行灰度分析,用SPSS13.0统计软件采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),用LSD法对组间数据进行多重比较。实验重复三次用于统计分析,即样本量为3。(三)结果新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48h,用4μmol/L Forskolin处理6h和12h诱导tau蛋白过度磷酸化,应用DMSO作为溶剂对照,进行免疫印迹,检测原代海马神经元细胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1,结果显示：在4μmol/L Forskolin作用6h和12h,原代海马神经元细胞周期蛋白cyclinD1和cyclin B1的水平均升高(cyclin D1:F=433.106, P<0.005; cyclin B1: F=39.135, P<0.005)。新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48h,用4μmol/L Forskolin处理6h诱导tau蛋白过度磷酸化,进行免疫荧光双标,检测Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位,结果显示：4μmol/L Forskolin处理6h, tau蛋白Ser214位点的磷酸化水平增高,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位,Ser214位点过度磷酸化的tau蛋白和细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞质。新生1天SD大鼠原代海马神经元培养48h,用4μmol/L Forskolin处理12h诱导tau蛋白过度磷酸化,进行免疫荧光双标,分别检测Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位,结果显示：4μmol/L Forskolin处理12h, tau蛋白Ser396和Ser202/Thr205位点的磷酸化水平均增高,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,Ser396和Ser202/Thr205位点过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均存在共定位,Ser396和Ser202/Thr2O5位点过度磷酸化的tau蛋白以及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞质。(四)结论4μmol/L Forskolin诱导海马神经元tau蛋白过度磷酸化的同时,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,过度磷酸化的tau蛋白与细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位。